PCR與RFLP方法快速診斷細菌感染的應用與臨床價值分析

邵華

[摘要] 目的 分析細菌感染診斷中應用PCR與RFLP方法快速診斷的價值。 方法 將已知菌7株與2013年1月—2017年12月臨沂市第三人民醫院接診的臨床確診為生殖道炎癥病變35例患者的標本作為研究對象，均進行PCR與RFLP方法快速診斷，將快速診斷結果與臨床診斷進行比較。 結果 PCR診斷已知菌陽性率為85.71%（6/7），而PFLP診斷均為100.00%；已知菌的PCR擴增產物酶切片片段長度實驗結果與RFLP電子克隆結果基本一致，差異無統計學意義（χ2=1.004 8、2.005 1、3.011 6、3.045 2，P>0.05）。結論 相比傳統細菌培養法診斷細菌感染，PCR與RFLP方法快速診斷有著快速、靈敏、準確等優勢，可以明顯縮短診斷時間，可直接鑒定臨床標本，值得借鑒。

[關鍵詞] 細菌感染；生殖道炎癥；PCR；RFLP；價值；分析

[中圖分類號] R5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2018）06（b）-0014-03

Analysis of Application of PCT and RFLP Method in Rapid Diagnosis of Bacterial Infection and Its Clinical Value

SHAO Hua

Department of Clinical Laboratory， People's Hospital of Linyi Economic and Technological Development Zone & Linyi Third Peoples Hospital， Linyi， Shandong Province， 276000 China

[Abstract] Objective To analyze the application of PCT and RFLP method in rapid diagnosis of bacterial infection and its clinical value. Methods 7 strains of know bacterial and 35 cases of patients with inflammatory lesions of the genital tract confirmed by our hospital from January 2013 to December 2017 were selected as the research objects for PCR and RFLP rapid diagnosis， and the rapid diagnosis results and clinical diagnosis results were compared. Results The positive rate of known bacterial diagnosed by PCR， and positive rate of PFLP diagnosis were respectively 85.71%（6/7） and 100.00%， and the fragment length of the PCR amplified products of the known bacteria was basically consistent with the results of RFLP electron cloning， the difference was not statistically significant（χ2=1.004 8， 2.005 1， 3.011 6， 3.045 2， P>0.05）. Conclusion The PCR and RFLP rapid diagnosis is rapid， sensitive and accurate compared with the traditional germiculture in diagnosis bacterial infection， which can obviously shorten the diagnosis time and directly identify the clinical specimens， and it is worth reference.

[Key words] Bacterial infection； Inflammation of the genital tract； PCR； RFLP； Value； Analysis

生殖道炎癥屬于比較常見的多發性疾病，這種疾病多因細菌感染所致，盡早診斷與治療是防治關鍵。微生物感染常用的診斷方式為分離培養及鑒定，盡管準確率高，但其比較耗時，方法也相當繁瑣[1-3]。為了探討這種快速方法診斷細菌感染的價值，該文就2013年1月—2017年12月臨沂市第三人民醫院收治的35例經臨床確診的生殖道炎癥疾病患者與已知菌7株實施了研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將已知菌7株與臨沂市第三人民醫院接診的臨床確診為生殖道炎癥病變35例患者的標本作為研究對象，患者均為該院收治的陰道炎與宮頸炎患者，年齡20～67歲，均值（45.9±5.4）歲；陰道炎23例、宮頸炎12例。此外，入選對象和（或）家屬簽署知情同意書愿意配合研究，且該研究經該院醫學倫理委員會批準通過。

1.2 方法

1.2.1 菌株類型 共計7株菌株類型，為該市某醫院微生物室保存及提供，包括大腸埃希菌（ATCC 25922）、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、屎腸球菌及衣氏放線菌。

1.2.2 標本提供 包括人白細胞DNA、白假絲酵母菌DNA及HBV-DNA陽性血清標本，均由上述醫院檢驗科提供。

1.2.3 主要的試劑及相關的儀器 該次研究中涉及的試劑與儀器如下：PCR反應試劑盒、限制性內切酶Hae Ⅲ、HBV DNA提取試劑盒、酶切緩沖液10×M Buffer（2 μL）、酶切位點、毛細管（45×50 μm）、去離子甲酰胺、POP-Polymen、GeneScan 500ROX、瓊脂糖、PCR熱循環儀、凝膠成像儀、Mupid電泳儀等。

1.2.4 細菌培養 所有患者均采取生殖道標本，以棉拭子從生殖道獲取標本，接種在瓊脂培養基與巧克力瓊脂培養基，以及伊紅美藍瓊脂培養基、淋病奈瑟菌培養基中，溫度為37℃，時間18～24 h。

1.2.5 熒光標記引物 熒光標記引物采取合成16SrRNA基因序列引物，其中序列情況如下：①上游引物：5（FAM）-ACACTGGAACTGAGACACGG-3；②下游引物：5–CTCTACGCATTTCACCGCTAC-3。

1.2.6 PCR模板制備 ①標本PCR模板：從宮頸或陰道用拭子取標本1.5 mL放于無菌離心管，加1 mL無菌水，反復振蕩混懸后將拭子棄去，以1 500 r/min離心5 min，取0.5 mL上清液，然后繼續以15 000 r/min離心10 min，棄去上清液后以無菌水進行洗滌沉淀，反復操作3次，每次離心速率為15 000 r/min、時間為10 min，最終取15 μL沉淀加0.2 mL微量離心管，99℃裂解10 min后浸入冰浴待用。②已知菌PCR模板：收集培養的細菌，用無菌水配制0.5麥氏單位菌懸液，取15 μL加微量離心管后，裂解后置入冰浴待用。

1.2.7 PCR擴增 取dNTP混合物4 μL、10×ExTaq Buffer 5 μL、引物1與引物2各2 μL，以及15 μL模板、0.25 μL的1.25 U TaKaRa Ex Taq及無菌水，控制總體積50 μL，PCR擴增時將反應體系管置入離心機中，以3 000 r/min離心速率處理30 s，置入PCR熱循環儀中擴增，反應的條件包括預變性94℃ 1 min、變性98℃ 15 s、退火55℃ 1 min、延伸72℃ 1 min，共計30周循環，之后置入4℃保存待檢。

1.2.8 酶切 取擴增產物2 μL，加入2 μL buffer、1 μL Hae Ⅲ及15 μL無菌水，37℃孵育1 h，置入-20℃冷凍保存。

1.2.9 RFLP分析 將酶切產物1 μL和24 μL去離子甲酰胺與1 μL ROX混勻后，95℃變性2 min，快速冰浴冷卻，實施RFLP分析，其中電壓15 kV、電流12 μA、溫度60℃、功率9.9 mW、時間25 min。

1.3 統計方法

該次研究數據采取SPSS 20.0統計學軟件處理，計數資料用[n（%）]表示，采取χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 已知菌PCR及RFLP診斷結果情況

PCR診斷已知菌，其中陽性有大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、屎腸球菌6種，而衣氏放線菌為陰性，陽性率為85.71%（6/7），而PFLP診斷為100.00%。

2.2 已知菌PCR擴增產物的PCR與RFLP結果

已知菌的PCR擴增產物酶切片片段長度實驗結果與RFLP電子克隆結果基本一致，差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

3 討論

生殖道感染屬于常見疾病，多為細菌感染所致，在女性中除了會造成盆腔炎與不孕不育等，還可能導致性傳播疾病、新生兒先天性疾病等[4-6]，為此盡早明確診斷與處理十分必要。傳統診斷方式為分離培養法，被公認為金標準，但耗時長，生長緩慢、無法人工培養及條件苛刻等情況下的標本不宜采用[7-11]，為此需尋求一種準確、快速的診斷方式。

在該次研究中顯示PCR診斷已知菌陽性率為85.71%（6/7），生殖道炎癥標本陽性率為82.86%（29/35），而PFLP診斷均為100.00%；已知菌的PCR擴增產物酶切片片段長度實驗結果與RFLP電子克隆結果基本一致，差異無統計學意義（P>0.05）。該研究結果與同類研究相似，李琳等學者[12]采取16S rRNA集技術對已知菌8株、生殖道炎癥標本及其培養物38例進行PCR擴增與限制性內切酶處理，并予以RFLP鑒定不同病原菌，結果顯示已知菌擴增陽性率為75%，生殖道感染標本PCR擴增陽性率則為79%，RFLP陽性率均為100%；已知菌株PCR擴增產物5端HaeⅢ完全酶切片段的RFLP結果和電子克隆產物酶切片段基本相同，差異無統計學意義（P>0.05）。PCR與RFLP快速診斷方法能將細菌鑒定到種，測定時間不超過24 h，單份標本能單獨測定[13-16]，而且實際操作中不做酶切者當日便可檢出結果，需酶切者次日也可獲取檢測結果，這種方法對象為細菌核酸，和傳統細菌培養相比，靈敏度更高，耗時更短，使得假陰性結果更少，在各類細菌感染中均可快速明確診斷[17-20]。

綜上所述，相比傳統細菌培養法診斷細菌感染，PCR與RFLP方法快速診斷有著快速、靈敏、準確等優勢，可以明顯縮短診斷時間，可直接鑒定臨床標本，值得借鑒。

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（收稿日期：2018-03-15）