單增李斯特菌恒溫熒光PCR檢測方法的建立及應用

賈培 盛司潼 蘭全學

摘 要：以單增李斯特菌的clfA基因為靶序列，針對該序列保守區，設計引物和探針，建立單增李斯特菌熒光PRA檢測方法，研制單增李斯特菌熒光PCR快速檢測試劑盒，并對其特異性、靈敏性、穩定性進行分析。結果表明該恒溫熒光PCR方法及快速檢測試劑盒特異性好、穩定性好、具有較高的靈敏度，最低可檢測到0.05 pg/μL，是快速檢測食源性增李斯特菌的有效方法，對我國食源性增李斯特菌的檢測具有重要應用和推廣價值。

關鍵詞：單增李斯特菌；恒溫熒光PCR；試劑盒

中圖分類號：R155 文獻標志碼：A

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）（以下簡稱單增李斯特菌）屬于革蘭氏陽性菌，是最常見的人畜共患型食源性致病菌之一，能夠引起較嚴重的人畜共患病，象腸胃炎、腦膜炎、敗血癥等疾病，孕婦、嬰幼兒、老年人及免疫力低下者更易感染。單增李斯特菌廣泛存在于各類乳制品、蔬菜、肉類等食品中，具有極強的生命力，其能夠在-4 ℃～45 ℃，pH值為4～9，甚至高鹽（14 %及以上）等惡劣環境條件下生存。對人的健康構成了極大威脅。食品中單增李斯特菌的檢測技術則成為食源性疾病預防與控制的關鍵。因此，開發一種高效、靈敏的快速檢測單增李斯特菌的方法及試劑盒迫在眉睫。

該研究擬根據單增李斯特菌的clfA基因的保守序列，設計RPA檢測所需的引物及探針，建立一種能夠快速檢測單增李斯特菌的簡便、高效、特異、靈敏、適于現場快速檢測的技術方法，研制出單增李斯特氏菌核酸檢測試劑盒（RPA—熒光法）對單增李斯特菌擴增結果進行檢測，并對其特異性、靈敏度、穩定性進行測試。

1 材料與方法

1.1 試劑與耗材

實驗所用的標準菌株—單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）（菌株編號ATCC 19115）由廣東環凱微生物科技有限公司代買；細菌DNA提取試劑盒，寶生物工程有限公司；RPA擴增試劑盒，TwistDX公司；Premix預混合液，寶生物工程有限公司；引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 主要儀器

恒溫金屬浴，HYK公司；qPCR儀，ABI；PCR儀，Labnet；Flurometer，ABI；NanoDrop，Thermo等。

1.3 引物、探針的設計與合成

擬利用NCBI數據庫對目前相關分子生物學檢測單增李斯特菌的常用靶基因進行BLAST分析，進行數據的比對分析，從中查詢適用于RPA檢測的靶序列，以此來設計引物及探針（見表1），所擴增的基因序列作為檢測單增李斯特菌的靶基因。

1.4 模板DNA的制備

將單增李斯特菌在37 ℃條件下震蕩過夜培養，按照寶生物工程有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取DNA，分為菌體裂解，DNA與膜結合，DNA純化等過程，取上清液作為檢測模板，在-20 ℃的條件下保存備用。

1.5 反應體系和反應程序的建立

將單增李斯特菌培養后，提取DNA模板，進行熒光PCR擴增。反應體系為50 μL：包括測試buffer 45.5 μL（水化buffer 29.5 μL，去離子水11.2 μL，探針0.6 μL，上下游引物各為2.1 μL）、DNA模板2.0 μL、Mg2+2.5 μL。反應時間20 min，反應溫度為37 ℃，30 s/循環，30個循環，熒光收集信號。

1.6 特異性分析

制備菌株DNA樣品，使用96孔板，按以下方式均勻混合制備待測樣品并進行排版，見表2，反應體系和程序參考1.5。

1.7 靈敏度分析

取1 mL菌株培養液，提取DNA（濃度為5.34 ng/uL），以此為模板，用水分別稀釋10倍、100倍、1 000倍、10 000倍、100 000倍等5個梯度；取3管凍干粉，加入136.5 μL測試buffer，每管平分22.75 μL，再加入1 μL稀釋模板和陰性對照樣品，1.25 μL醋酸鎂溶液，測試5個模板梯度和一個陰性對照。

1.8 穩定性測試

通過加速實驗確定試劑盒的穩定性，設計3個保存溫度，分別為25 ℃、35 ℃、45 ℃，放置天數分別為2天、8天、14天、17天；每個條件取配置700 μL測試buffer，每個溫度條件每個時間節點取45.5 μL buffer和1管凍干粉（作為一個獨立包裝）；將每個包裝的凍干粉用對應的buffer溶解，然后配制成2個25 μL的反應體系（參照1.5），由于樣品較多，采用冰上加樣方式，確保反應同時開始；）測試采用試劑盒提取的基因組DNA樣本，對應的樣品濃度為單增李斯特菌18.3 pg/μL。

2 結果與分析

2.1 單增李斯特氏菌核酸檢測試劑盒（RPA—熒光法）的特異性

利用所建立的恒溫熒光PCR檢測試劑盒檢測單增李斯特菌，結果如圖1所示，待測陽性樣品均有擴增曲線，空白對照的擴增曲線呈陰性，從而說明熒光PCR檢測試劑盒的單增李斯特菌特異性良好，能夠有效地將單增李斯特菌從其他菌中區分出來。

2.2 單增李斯特氏菌核酸檢測試劑盒（RPA—熒光法）的靈敏度

利用熒光PCR方法開發的快速檢測試劑盒分別對不同濃度的模板進行檢測，如圖2所示，空白對照試驗無擴增曲線，證明測試結果有效，最低檢測限對應樣品濃度為單增李斯特菌0.05 pg/?L。從而表明熒光RPA快速檢測試劑盒檢測單增李斯特菌的靈敏度可以達到0.05 pg/μL。

2.3 單增李斯特氏菌核酸檢測試劑盒（RPA—熒光法）的穩定性測試

單增李斯特氏菌核酸檢測試劑盒在3種不同溫度條件下顯示（見表3），溫度每升高10 ℃，反應速率就會增加2～4倍，反之溫度每降低10 ℃，反應速率就會降低2～4倍，按照降低2倍的參數計算，從-20℃～25 ℃，溫度降低了4.5個10 ℃，反應速率降低22倍，25 ℃下放置17天的變化等同于-20 ℃放置374天。對數據進行低溫折算（見表4），發現均在180天以上，據此試劑盒的有效期至少可判定為：-20 ℃保存6個月。

以偏差在20%以內的變化作為接受標準，統計不同試劑盒在不同溫度下的最長保存天數。

2.4 討論

單增李斯特菌是引起食源性疾病的常見致病菌，該研究所開發的熒光RPA方法及檢測試劑盒可以快速高效地檢測單增李斯特菌。相比于目前的傳統培養方法、熒光PCR方法，恒溫熒光PCR方法檢測時間短，在20 min內就可以得到檢測結果；通過靈敏度實驗發現，該方法特異性好，穩定性好，對于單增李斯特菌的檢測靈敏度可以達到0.05 pg/μL。 此外，傳統培養方法的檢測過程煩瑣，熒光PCR方法的檢測過程包括預變性、變性、退火、延伸等步驟，且每個過程都需要不同溫度，這就迫使熒光PCR方法需要溫度調節裝置，設備費用高，而熒光RPA方法是一種等溫擴增程序，且反應溫度在35 ℃～42 ℃，不需要復雜的溫度控制裝置。因此開發熒光RPA方法及快速檢測試劑盒檢測單增李斯特菌具有重要的實際意義。

參考文獻

[1]Gasanov U，Hughes D，Hansbro P M.Methods for the isolation and identification of Listeria spp. and Listeria monocytogenes：A review[J].FEMS Microbiol Rev，2005，29（5）：851-875.

[2]Louren?o A，Kamnetz M B，Gadotti C，et al.Antimicrobial treatments to control Listeria monocytogenes in queso fresco[J].Food Microbiology，2017，64（Complete）：47-55.

[3]Melo J，Andrew PW，Faleiro ML.Listeria monocytogenes in cheese and the dairy environment remains a food safety challenge：The role of stress responses[J].Food Res Int，2015（67）：75-90.

[4]劉冬虹，王德蓮，郭燕華，等.重組酶聚合酶擴增技術的研究進展[J].檢驗檢疫學刊，2016，26（5）：65-68.

[5]劉芳，徐振娜，洪偉彬，等.食品中單增李斯特菌熒光PCR檢測方法的建立[J].食品科學，2017，28（17）：84-91.