一種配制型塊菌蘋果醋的研制

吳樹坤，黃治國，衛春會，宗緒巖，鄧杰

（四川理工學院釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川自貢643000）

塊菌是屬子囊菌門的一類大型真菌[1]，也是世界上最珍貴的藥食用菌之一，通常需要與木本植物形成共生關系才能得以生長[2]。塊菌營養成分豐富，含有多種易被人體吸收的氨基酸、無機鹽[3]和有促進免疫功能和抗腫瘤活性的多糖等[4]，塊菌中含有的神經酰胺具有較好的保濕作用，可廣泛運用于美容行業[5]，其含有的α-雄烷醇化學結構與人體性激素相似，具有調節女性月經周期等功能[6]。此外，還可作為輔料制成各類食品，備受美食界喜愛[7]。無論作為保健食品還是功能藥物都極具價值，故塊菌素有“林中黑鉆石”的美譽[8]。

蘋果醋作為蘋果深加工的產物，具有蘋果的典型風味且營養價值高于普通食醋，其特有的風味可使其同普通飲料一樣可直接飲用。蘋果醋含有豐富的有機酸[9]和數種人體必需的氨基酸[10]、維生素等物質[11]，具有調節血糖[12]、血壓，促進食欲[13]、軟化血管[14]、抗氧化[15-18]等功能，其含有的乙酸等能進入機體參與三羧酸循環緩解身體疲勞[19]，而豐富的抗壞血酸則可增加人體免疫力，延緩衰老的功能[20]。目前，關于保健果醋研制的報道較多[21-24]，但鮮有以感官評價為研制標準且對自身產品中活性物質清晰闡明的報道。本研究擬用蘋果釀制成醋，以感官評價為標準，通過正交試驗優化蘋果醋與塊菌提取物及蔗糖的調配比例，并檢測其α-雄烷醇、氨基酸及揮發性成分的含量。研制一款不僅具有蘋果-塊菌混合果香味，而且在口感上又能適應多數消費者，此外還具有一定保健功能的利口果醋，此產品具有較好的市場前景和經濟價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮紅富士蘋果、塊菌：市售；安琪酵母：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌由四川理工學院釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室提供。

乙醚（分析純）、食用酒精：國藥集團化學試劑有限公司；氫氧化鈉、硫酸銅、檸檬酸（均為分析純）：成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

7890A氣相色譜-質譜聯用儀：美國安捷倫公司；L－8900型氨基酸自動分析儀：日本HITACHI公司；DK-98-1型電子恒溫水浴鍋：天津泰新特儀器有限公司；WYT-ⅡA型手持折光儀：成都市格納絲商貿有限公司；SG260-A型榨汁機：好夫人電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果醋的釀制工藝

1.3.1.1 工藝流程

1.3.1.2 操作要點

蘋果汁的制備：將新鮮無腐爛的蘋果用清水洗凈并削皮去核，切成小塊浸泡在0.05%的VC溶液中進行護色，隨后榨汁。

成分調整：使用手持折光儀用蔗糖將蘋果汁糖度調整為15%，用檸檬酸將pH值調整為3.5。

酒精發酵：將活化好的酵母（0.2%安琪干酵母，4%葡萄糖在37℃活化15 min，再以33℃活化1 h～2 h）以10%的比例接種至滅菌（溫度控制在80℃～85℃，保持30 min）的蘋果汁中，發酵溫度控制在28℃，每天旋轉發酵罐2次～3次，并測定果汁糖度和酒精度的變化。

醋酸發酵：將蘋果酒加熱至70℃左右保持15 min，冷卻后將其酒精濃度調整為6%（20℃），再向發酵罐中以10%的比例接入活化的醋酸菌（3%乙醇，0.25%醋酸菌，1%葡萄糖，1%酵母膏，0.5%CaCO3于40℃，140 r/min活化48 h）。發酵溫度37℃，每天檢測酒精度與醋酸的變化。

澄清：采用加熱澄清法[25]，即將發酵液在80 s～90 s內加熱到80℃左右，然后急速冷卻至室溫，隨后用硅藻土作助濾劑過濾。即得蘋果原醋。

1.3.2 塊菌多糖的提取

1.3.2.1 工藝流程

1.3.2.2 操作要點

浸提：以塊菌∶40%乙醇溶液=1∶5（g/mL）的比例浸提30 min，每隔5分鐘攪拌1次，過濾后，濾渣再重復浸提兩次。

濃縮：將塊菌提取液體積濃縮至與初始塊菌質量一樣的值。即得用于調配的塊菌提取液。

1.3.3 理化指標的測定[26]

酒精度的測定：酒精計法；糖度的測定：斐林試劑法；酸度的測定：酸堿滴定法。

1.3.4 α-雄烷醇的測定[27]

1）樣品預處理

由于塊菌中α-雄烷醇含量極低，檢測前需將200 mL用于調配的塊菌提取液與100 mL重蒸乙醚充分振蕩混合進行液液萃取，靜止分層后，取上層溶液，并重復萃取一次，最后用旋轉蒸發儀濃縮至1 mL。立即進行氣相色譜-質譜聯用儀（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析。

2）α-雄烷醇的標準曲線繪制

將10 mg的α-雄烷醇標準品用丙酮溶解，定容到10 mL，然后再配制成濃度分別為 20、50、100、150、200 μg/mL的α-雄烷醇標準品，用GC-MS定量檢測，繪制標準曲線。

3）α-雄烷醇的檢測

氣相色譜（GC）條件：DB-WAX毛細管色譜柱（60.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度 230℃；升溫程序為40℃保持3 min，10℃/min升到180℃，再以20℃/min升到230℃保持10 min；載氣99.999%氦氣，載氣流速為 0.8 mL/min，進樣量 1 μL；分流比：20 ∶1。

質譜（MS）條件：電離方式為電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量 70 eV，離子源溫度 230 ℃，四極桿150℃，傳輸線溫度230℃，全掃描模式，掃描質量范圍25 amu～500 amu，溶劑延遲3 min。

1.3.5 塊菌蘋果醋飲料調配方法

采用L9（34）正交試驗，以蘋果醋、塊菌提取液、蔗糖為影響因素，選擇出蘋果醋塊菌飲料的最佳調配組合。

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

1.3.6 蘋果醋的感官評定方法

按照正交試驗的原料比例進行塊菌蘋果醋的配制，制得9組樣品。然后，邀請10位視覺、嗅覺、味覺良好的專業人員進行感官評定，評定標準見表2，每組樣品的感官評分取平均值。

1.3.7 氨基酸的測定

最優調配比例的塊菌蘋果醋中游離氨基酸的測定方法參照文獻[28]。

1.3.8 塊菌蘋果醋中揮發性風味成分的測定

以乙酸丁酯作為內標，對最優調配比例的塊菌蘋果醋中揮發性風味成分進行半定量，具體方法參照文獻[29]。

表2 感官評定標準表Table 2 Standard table for sensory evaluation

1.4 數據分析

單因素試驗每組重復3次，試驗結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 20軟件進行方差分析；正交試驗采用極差分析。

2 結果與分析

2.1 蘋果醋釀制過程酒精度、糖度及酸度的變化

2.1.1 酒精發酵過程酒精度和糖度的變化

本試驗研究蘋果汁酒精發酵過程酒精度和糖度的變化，結果見圖1。

圖1 酒精發酵過程酒精度和糖度的變化Fig.1 The changes of alcohol content and sugar content at alcohol fermentation process

如圖1所示，蘋果汁的糖含量在發酵的前5天均每天顯著減小（p＜0.05），而酒精含量在發酵的前5天均每天顯著增加（p＜0.05）；這是由于發酵前期蘋果汁中糖含量充足且有一定的溶氧，各種營養物質充足，有利于接種的酵母迅速生長和代謝。但發酵至6天后，蘋果汁中糖含量和酒精含量的變化均不顯著（p＞0.05），發酵至第7天糖含量降至2.9%，酒精含量升至5.3%vol；這是由于后期發酵環境變得惡劣，溶氧不足，營養物質匱乏，使酵母的生命活力降低，故而酵母代謝受阻，因此糖含量和酒精含量變化緩慢。故可推斷蘋果汁酒精發酵的1 d～5 d為主發酵期。本試驗結果與衛春會等[30]對蘋果醋的研究結果一致。

2.1.2 醋酸發酵過程中酸度和酒精度的變化

本試驗研究了蘋果醋醋酸發酵過程中酸度和酒精度的變化，結果見圖2。

圖2 醋酸發酵過程中酸度和酒精度的變化Fig.2 The changes of acidity and alcohol content at acetic acid fermentation process

如圖2所示，蘋果酒的酒精含量在發酵的前4天均顯著降低（p＜0.05），而總酸含量在發酵的前4天均每天顯著增加（p＜0.05），這是由于發酵前期蘋果酒中底物充足，使醋酸菌生長并消耗酒精代謝產生醋酸。但發酵至4天后，蘋果酒中總酸含量的變化不顯著（p＞0.05），而在發酵至5天后，酒精含量的變化也不顯著（p＞0.05），發酵至第 6 天酒精含量降至 1.43%vol，總酸含量升至21.6 g/L，這是由于發酵后期酸度的增加且營養物質貧乏，使醋酸菌生長代謝活力降低[31]。故可推斷蘋果醋醋酸發酵的1 d～4 d為主發酵期。

2.2 塊菌蘋果醋飲料的調配結果

正交試驗采用蔗糖、塊菌提取液和蘋果原醋通過不同的比例進行調配，并根據表2標準進行感官評價。評分結果見表3。

由表3可知，塊菌蘋果醋飲料的調配過程中，隨著蔗糖添加量增加，感官評分先降低后升高；隨著塊菌提取液和蘋果醋量的增加，感官評分均逐漸增加。通過極差分析可得，各因素對塊菌蘋果醋感官影響的主次順序為塊菌提取液＞蔗糖＞蘋果醋。塊菌蘋果醋最優的調配條件為A3B1C3，即蔗糖7 g，快菌提取液11 mL，蘋果原醋34 mL。而試驗組中評分最高的為第7組（94分），且其調配比例與分析所得的最優條件一致，故無需再進行驗證試驗。

表3 正交試驗結果表Table 3 The results table of orthogonal test

2.3 塊菌提取液中α-雄烷醇的檢測

2.3.1 α-雄烷醇的標準曲線

本試驗以α-雄烷醇作為標準品，用氣相-質譜聯用儀對不同濃度的標準品進行分析，對不同濃度的標準品用氣相色譜定量分析得到的色譜數據，用標準品檢測的濃度對應的峰面積制到標準曲線（圖3），并得到回歸方程為y=293 084x+60，決定系數R2＝0.984 1。

圖3 α-雄烷醇標準曲線Fig.3 Standard curve of alpha male alkanol

2.3.2 塊菌提取液中α-雄烷醇的含量

通過氣相色譜檢測，α-雄烷醇的峰面積為11 304，另一個α-雄烷醇的同分異構體的峰面積為414 674，由線性回歸方程可得，α-雄烷醇的濃度為0.038 4 μg/mL，α-雄烷醇同分異構體的濃度為1.145 μg/mL，即塊菌中α-雄烷醇的含量為0.019 2 μg/100 g，其同分異構體的含量為0.707 μg/100 g。由于塊菌中α-雄烷醇的含量極低，難以檢測，且目前關于塊菌中α-雄烷醇的檢測方法報道較少。王冠等[27]采用液體發酵法發酵松露，再對發酵液進行α-雄烷醇的檢測，其α-雄烷醇含量最高可達123.5 ng/mL。但此法無法解釋α-雄烷醇是由發酵產生還是塊菌中自身所有。

2.4 塊菌蘋果醋中游離氨基酸的含量

根據2.2中所得的塊菌蘋果醋最佳調配比例進行組合，并對其進行各游離氨基酸的含量的測定，結果見表4。

表4 各游離氨基酸的含量Table 4 Content of free amino acids

如表4所示，塊菌蘋果醋中一共檢測出12種氨基酸，氨基酸總含量為288.43 mg/100 mL，其中包括賴氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸6種必需氨基酸，且必需氨基酸的含量為32.41 mg/100 mL，占氨基酸總含量的11.24%，甲硫氨酸可能因含量較低，未被檢出。蘋果醋中氨基酸的來源主要為蘋果自身含有和發酵過程中產生的氨基酸，張海濤等[10]的研究表明，蘋果汁通過發酵，會增加其氨基酸的種類，如賴氨酸、異亮氨酸等。這些氨基酸很大程度上提高了蘋果飲料的營養價值。

2.5 塊菌蘋果醋中揮發性風味成分的測定

根據2.2中所得的塊菌蘋果醋最佳調配比例進行組合，并對其揮發性風味成分進行分析，結果見表5。

表5 揮發性風味成分的含量Table 5 Content of volatile flavor components

續表5 揮發性風味成分的含量Continue table 5 Content of volatile flavor components

如表5所示，一共檢測出24種揮發性風味成分，總含量為46.72 mg/100 mL，其中包括15種酯類物質，占總數的62.5%，總酯含量為11.215 mg/100 mL，占總揮發性風味含量的24%。經感官評價，該塊菌蘋果醋具有蘋果和塊菌的混合果香味，香味飽滿且無刺激味。酯類物質主要來自原料和發酵過程中產生，在果醋、果酒及飲料中均是主要的呈香物質[32]。且在果醋、果酒揮發性風味成分的研究中，酯類物質的檢測也是必不可少的[33-34]。

3 結論

本試驗通過L9（34）正交試驗優化塊菌蘋果醋的調配比例，研究結果表明當調配比例為蔗糖7 g，快菌提取液11 mL，蘋果原醋34 mL時，綜合感官評分最高；此比例調配出的塊菌蘋果醋飲料的色澤靚麗，滋味協調，且具有蘋果和塊菌的混合果香味，香味飽滿且無刺激味。同時根據最優調配比例，分析了塊菌蘋果醋中氨基酸含量和風味成分含量，共檢測出了12種氨基酸（含量為288.43 mg/100 mL），其中包含6種必需氨基酸（含量為32.41 mg/100 mL），而必需氨基酸在人體一旦缺乏，將會影響人體的生理機能，使其抵抗力下降等[35]。此外還檢測出了24種風味物質，其中包含15中酯類物質，其香氣不僅帶有蘋果的果香還具有塊菌中特殊的香味。此外，塊菌中α-雄烷醇及其同分異構體的含量分別為 0.019 2 μg/100 g 和 0.707 μg/100 g，α-雄烷醇屬于類固醇物質，與其同分異構體結構相似，均為稠和四環化合物。由此可以推斷它們在某些功能方面可能具有相似的作用。綜合試驗結果，本試驗研制的塊菌蘋果醋不僅香味濃郁，滿足大眾口感，而且還具有豐富的氨基酸和其他功能物質，為利口、保健蘋果醋飲料的開發提供了一條新的途徑。