響應面法優化超聲波-微波協同提取黑果枸杞葉總黃酮工藝

段亞云，李建穎，程瑤，李金榮

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum）為茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium）植物，主要生長在荒地、沙漠等較干旱地區。在我國主要分布于山西北部、寧夏、甘肅、青海、新疆等省份[1]，是我國西北荒漠地區極其珍貴的藥食兩用珍品，亟待開發[2]。其果實可以滋肝補腎，調節氣血，明目降壓[3]，其葉可以制茶，降血脂，抗衰老。黃酮類物質是植物中重要的次生代謝產物之一，具有吸收紫外線、抗癌、抗氧化、免疫等多種功效[4-5]，目前廣泛應用于食品工業、醫療保健和化妝品等行業[6]。現代研究表明[7-8]，黑果枸杞葉中含有豐富的黃酮類物質，且其具有廣泛的生理活性和營養保健作用。研究黑果枸杞葉總黃酮的提取工藝對于進一步開發利用黑果枸杞具有重要意義。

超聲波對黃酮類化合物的提取主要源于其空化作用，致使溶液內部產生較強的沖擊波，同時伴有強烈的機械效應和熱效應，能從整體上提高提取過程的傳質速率和效果，縮短提取時間[9-10]。微波對分子間作用力以及氫鍵等具有較強的破壞力，是一種非電離的電磁輻射。相比較超聲波來說，微波可使溶劑和溶質均勻受熱，克服了熱水浸提法易糊化的缺點，有利于細胞中有效成分的溶出，且時間短，用量少，效率高。因此，超聲波-微波協同提取法可以將兩種方法結合起來，實現優勢互補，從而可獲得更高的提取率[11]。本試驗將采用超聲波-微波協同提取技術，研究不同因素條件對黑果枸杞葉總黃酮提取率的影響，通過響應面優化試驗確定最佳工藝條件，為黑果枸杞葉的綜合開發提供理論依據和數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑果枸杞葉：甘肅省民勤縣；蘆丁（Standard）：德國Dr.Ehrdnstorfer Gmbh公司；乙醇（AR）：天津市凱通化學試劑科技有限公司；鹽酸（AR）、氫氧化鈉（AR）、硝酸鋁（AR）、亞硝酸鈉（AR）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

BSA224S-CW分析天平：德國Sartorius集團；RV10DIGITAL旋轉蒸發儀：德國IKA公司；UV-2600紫外可見分光光度計：日本Shimadzu；RV10DIGI TALXO-SM50超聲波-微波協同反應系統：南京先歐儀器制造有限公司；Spex 6875冷凍研磨儀：美國Spex；DW-86L290（J）超低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司；DH-101電熱鼓風干燥箱：上海精密科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預處理

將黑果枸杞葉置于100℃烘箱中殺青30 min，后放入60℃干燥箱中，烘干至恒重，粉碎后過100目篩，置于干燥器中備用。

1.2.2 蘆丁標準曲線的制定

準確稱取0.0200g蘆丁標準品，置于100.0mL容量瓶中，用70%乙醇溶解定容，制成濃度為0.2000mg/mL的標準品溶液[12]。將上述溶液用70%乙醇稀釋成濃度為 0.000、0.010、0.020、0.040、0.080、0.120、0.160、0.180、0.200 mg/mL溶液。各取1 mL置于試管中，向其中分別加入1 mL70%乙醇和0.5 mL 5%的NaNO2溶液，混勻后靜置6 min。再加入0.5 mL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6 min，最后加入2 mL 4%NaOH，混勻后放置15 min。測定每組溶液在510 nm下的吸光度值。以蘆丁標準液濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線，求得回歸曲線方程A=9.515 15C+0.090 866 7（R2=0.999 3），線性范圍：0.008 mg/mL～0.028 mg/mL。

1.2.3 總黃酮提取工藝

準確稱量2.000 g處理好的黑果枸杞葉粉末，采用超聲波-微波協同反應系統（超聲頻率為40 kHz），通過改變微波功率、液料比、提取時間和乙醇濃度4個條件進行提取，旋蒸后將提取液置于-80℃超低溫保存箱內進行預凍24 h，將處理好的樣品進行冷凍干燥48 h，即得樣品粉末。

1.2.4 總黃酮含量的測定

取一定質量的待測樣品粉末，用70%乙醇溶解后取一定體積的樣品液，用70%乙醇定容至某一體積。取定容后的溶液1 mL，置于試管中。按1.2.2的方法測定待測溶液在510 nm下的吸光度值，帶入標準曲線中，求出粗提物中總黃酮的含量。根據算得的樣品液中總黃酮濃度，按如下公式，計算總黃酮提取率。

式中：x為樣品中總黃酮提取率，%；C為由回歸方程算得的樣液濃度，mg/mL；V1為樣液體積，mL；V2為樣品定容體積，mL；V3為顯色反應測定時取用樣品的體積，mL；m 為樣品質量，mg。

1.2.5 單因素試驗

1.2.5.1 微波功率對總黃酮提取率的影響

采用超聲波-微波協同提取的方法，以60%乙醇為提取溶劑，在液料比為25∶1（mL/g），超聲功率為200 W，提取時間12 min的條件下，分別在100、125、150、175、200 W的微波功率下提取黑果枸杞葉總黃酮。

1.2.5.2 液料比對總黃酮提取率的影響

采用超聲波-微波協同提取的方法，以60%乙醇為提取溶劑，在微波功率為200 W，超聲功率為200 W，提取時間 12 min的條件下，分別設定 10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL/g）的液料比條件，提取黑果枸杞葉總黃酮。

1.2.5.3 提取時間對總黃酮提取率的影響

采用超聲波-微波協同提取的方法，以60%乙醇為提取溶劑，在液料比為25∶1（mL/g），微波功率為200 W，超聲功率為200 W的條件下，分別設定6、8、10、12、14 min的提取時間，提取黑果枸杞葉總黃酮。

1.2.5.4 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

采用超聲波-微波協同提取的方法，在液料比為25∶1（mL/g），微波功率為 200 W，超聲功率為 200 W，提取時間12 min的條件下，分別采用50%、60%、70%、80%、90%的乙醇為提取溶劑，提取黑果枸杞葉總黃酮。

1.2.5.5 超聲功率對總黃酮提取率的影響

采用超聲波-微波協同提取的方法，以60%乙醇為提取溶劑，在液料比為25∶1（mL/g），微波功率為200 W，提取時間12 min的條件下，分別考察超聲功率為 100、200、300、400、500 W 對黑果枸杞葉總黃酮提取率的影響，發現超聲功率對其影響極不顯著，從節約能耗角度考慮，最終選擇超聲功率200 W。

1.2.6 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，運用Design-Expert 8.0軟件，根據Box-Behnken中心組合試驗原理[13]，分別選取微波功率（A）、液料比（B）、提取時間（C）及乙醇濃度（D）4個因素，以總黃酮提取率為響應值，設計響應面試驗，因素和水平見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 結果與分析

2.1 微波功率對總黃酮提取率的影響

微波功率對黑果枸杞葉總黃酮提取率的影響如圖1所示。

圖1 微波功率對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the extraction rate of total flavonoids

隨著微波功率的增大，提取率逐漸增大，在功率為175 W的時候，提取率達到最大值，因為初始階段，隨著功率的增大，微波作用逐漸加強，加速黃酮物質的溶解。但功率繼續增大時，提取率下降明顯，可能是因為隨著功率的進一步加強，溫度升高，會破壞一些黃酮物質[14]，也會導致部分溶劑揮發，致使提取率降低。所以微波功率以175 W左右為宜。

2.2 液料比對總黃酮提取率的影響

液料比對總黃酮提取率的影響如圖2所示。

圖2 液料比對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-soild ratio on the extraction rate of total flavonoids

隨著液料比的逐漸增加，溶劑對黃酮類物質進行更加充分的溶解，在液料比為20∶1（mL/g）時達到最大。但隨著液料比的進一步增大，可能會導致一些其他雜質成分溶出，降低總黃酮提取率[14]。最終選擇液料比為 20 ∶1（mL/g）。

2.3 提取時間對總黃酮提取率的影響

提取時間對總黃酮提取率的影響如圖3所示。

隨著提取時間的延長，總黃酮提取率逐漸增大，并在提取時間為10 min時達到最大值，但隨著時間的進一步延長，可能會導致部分黃酮類物質發生分解，致使提取率降低。所以，最終選擇提取時間為10 min。

圖3 提取時間對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.4 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

乙醇濃度對總黃酮提取率的影響如圖4所示。

圖4 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

隨著乙醇濃度的逐漸增大，總黃酮的提取率快速提高，但在乙醇濃度達到70%之后，提取率基本不再發生改變，可能是黑果枸杞葉黃酮更易溶于高濃度乙醇，為降低成本，最終選擇乙醇濃度為70%。

2.5 響應面優化黑果枸杞葉總黃酮提取條件

2.5.1 響應面試驗結果

以單因素試驗結果為基礎，依據Box-Behnken中心組合試驗原理，以黑果枸杞葉總黃酮提取率為響應值，進行響應面分析，試驗結果見表2。

表2 響應面試驗結果Table 2 Result of response surface test

續表2 響應面試驗結果Continue table 2 Result of response surface test

2.5.2 模型方程的建立與顯著性檢驗

采用Design-Expert 8.0軟件進行方差分析，獲得黑果枸杞葉總黃酮提取率對編碼自變量微波功率、液料比、提取時間和乙醇濃度的二次多項回歸。根據試驗結果建立的模型方程為：Y=0.99+0.021A-0.15B-0.027C-0.075D+0.022AB+0.028AC-0.035AD+0.071BC-0.12BD-0.002 8CD-0.24A2-0.32B2-0.39C2-0.27D2，分析結果見表3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續表3 回歸模型的方差分析Continue table 3 Variance analysis of regression model

模型方程中，各項系數的絕對值相對大小直接反映各因素對響應值的影響情況。此方程的二項式系數為負數，故方程圖像開口向下有最大值，可進行優化分析。由一次項系數分析得出，各因素對黑果枸杞葉總黃酮提取率的相對影響程度為：B（液料比）＞D（乙醇濃度）＞C（提取時間）＞A（微波功率）。由表3可知此模型極為顯著（P＜0.01），液料比與乙醇濃度為極顯著因素（P＜0.01），BD 交互極為顯著（P＜0.01），BC 交互顯著（0.01＜P＜0.05）。失擬項不顯著（P＞0.05），說明模型與實際情況擬合較好，使用該方程進行試驗分析是可行的。

2.5.3 響應面圖分析

為進一步研究各因素之間交互作用的影響，通過Design-Expert繪制的黑果枸杞葉總黃酮提取率三維響應面進行分析。響應面坡度都相對平緩，表明可以忍受處理條件的變異，等高線圖中同一橢圓型區域內表示提取率相同，中心最高，越向邊緣擴散越低，且橢圓曲線排列越密表明該因素對總黃酮提取率影響越大。同時等高線越接近圓型，說明兩因素交互作用越弱，越接近橢圓型，說明交互作用越顯著[15]。液料比和提取時間、乙醇濃度兩個因素之間的交互作用顯著（圖5、圖6），提取時間和微波功率之間交互作用較弱（圖7）。

圖5 液料比和提取時間對總黃酮提取率的交互作用Fig.5 Effect of interaction between liquid-soild ratio and extraction time on the extraction rate of total flavonoids

圖6 液料比和乙醇濃度對總黃酮提取率的交互作用Fig.6 Effect of interaction between liquid-soild ratio and ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

2.5.4 驗證試驗

由優化后的模型方程求解，可得出在試驗范圍內黑果枸杞葉總黃酮的最佳提取工藝：微波功率175.93 W，液料比 18.88 ∶1（mL/g），提取時間 9.89 min，乙醇濃度69.09%，在此條件下黑果枸杞葉總黃酮的提取率理論上可達1.01%。在實際試驗條件下，最佳提取工藝為：微波功率 175 W，液料比 18.9 ∶1（mL/g），提取時間9.9 min，乙醇濃度69%，并在此條件下進行3組平行試驗，所得的總黃酮提取率為（0.997±0.015）%，理論預測值為1.01%，結果與預測值基本符合，證明該模型有效。

圖7 提取時間和乙醇濃度對總黃酮提取率的交互作用Fig.7 Effect of interaction between extraction time and ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

3 結論

本文采用響應面法優化黑果枸杞葉總黃酮的提取工藝，通過對微波功率、液料比、提取時間和乙醇濃度4個因素的考察，液料比和乙醇濃度達到顯著水平，主次關系依次為：液料比＞乙醇濃度＞提取時間＞微波功率。利用Design-Expert 8.0軟件進行數據分析，并在實際試驗條件的矯正下，結果表明黑果枸杞葉總黃酮的最佳提取工藝為：微波功率175 W，超聲功率為200 W，液料比 18.9 ∶1（mL/g），提取時間 9.9 min，乙醇濃度69%。在此條件下提取得到的黑果枸杞葉總黃酮提取率為（0.997±0.015）%。利用超聲波-微波協同提取法對黑果枸杞葉總黃酮進行提取，最高提取率可達1.01%，明顯優于李淑珍等[16]乙醇浸提法，極大程度縮短了提取時間，且提取率明顯提高。