響應面法優化豬腦中神經節苷脂的硅膠柱層析純化

龔鳴敬，李雪聯，古明鮮，萬書林，管天冰，何平，王建，戴傳云，*

（1.重慶科技學院化學化工學院工業發酵微生物重慶市重點實驗室，重慶401331；2.重慶寰瑞生物技術有限公司，重慶401332；3.重慶璧山國家農業科技園區，重慶402760）

神經節苷脂是一類含有唾液酸的酸性鞘氨醇脂，廣泛分布于哺乳動物的腦組織細胞膜中，由于其具有促進腦神經元的成熟和受損神經的再生作用，因此對老年癡呆、心腦血管損傷及帕金森等神經性疾病的治療具有較好的臨床效應[1-2]。目前國內外對于神經節苷脂的分離與純化研究，提出了諸多方法如：丙酮提取法[3]、氯仿-甲醇抽提法[4]、四氫呋喃提取法[5]和索氏提取法[6]等，然而上述提取方法得到的產物仍含有較多雜質，主要包括磷脂、膽固醇、硫酸脂等[7]，如何獲取高純度的神經節苷脂，對其科學研究發展與應用具有重大意義。

硅膠柱層析作為經典的分離純化技術，具有選擇性高、干擾因素少、可重復循環利用等特點，已被廣泛用于食品、醫藥、農業等諸多領域[8-10]。本研究在傳統索氏提取工藝基礎上，利用響應面法試驗設計原理，采用紫外-可見分光光度法定量分析，探討神經節苷脂粗提物在硅膠柱層析的最佳純化工藝，以提高產物中神經節苷脂的純度，進而為其二次開發與利用提供條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬腦：市售；異戊醇、硫酸銅、丙酮、氯仿、甲醇、乙酸乙酯、間苯二酚、鹽酸（分析純）、硅膠（200目～300目）：國藥集團化學試劑有限公司；唾液酸標準品、神經節苷酯標準品：美國Sigma；試驗用水為二次純化水。

間苯二酚-鹽酸工作液：量取2%間苯二酚溶液10mL至100mL容量瓶中，加入含有0.25 mL、0.1 mol/L硫酸銅溶液的濃鹽酸80 mL，加水定容搖勻。

1.2 儀器與設備

722型分光光度計：上海儀電科學儀器股份有限公司；RE-501旋轉蒸發儀：鄭州華特儀器設備有限公司；BCD-221EMK3A型冰箱：海爾電器；202A-4型電熱恒溫干燥箱：蘇州市江東精密儀器有限公司；AE224型電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；SJIA-5FE冷凍干燥機：寧波雙嘉儀器有限公司；耐腐蝕層析柱（25 mm×500 mm）：泰州市蘇瑞玻璃儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 粗提物制備

取新鮮豬腦1 kg，勻漿攪拌后加入3 L氯仿-甲醇（體積比為1∶2），密封容器，攪拌過夜，次日離心（2 000 r/min、10 min），收集上清液。離心后的不溶物繼續加入氯仿-甲醇（體積比為1∶2），攪拌過夜后，次日離心（2 000 r/min、10 min），合并上清液，冷凍干燥，即為神經節苷酯的粗提物[4]。

1.3.2 硅膠柱層析

稱取定量的硅膠浸于洗脫劑內溶脹30 min，濕法裝柱，洗脫液平衡15 min后上樣，上樣速度2.5 BV/h，吸附平衡后，洗脫劑以2.0 BV/h流速洗脫，收集洗脫液，真空旋轉蒸發即得產物，通過下式計算得到產物的神經節苷酯回收率。

式中：m0為粗提物上樣量，g；w0為粗提物中神經節苷酯含量，%；md為產物質量，g；wd為產品中神經節苷酯含量，%；R為回收率，%。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 硅膠用量影響

分別配制濃度6%的樣品溶液，取相同體積加入至裝有 30、35、40、45、50 g 硅膠的層析柱中，經乙酸乙酯與甲醇（體積比為4∶1）的混合溶劑洗脫后，分別收集柱后洗脫液，測定各自神經節苷酯含量，計算其回收率。

1.3.3.2 上樣濃度影響

分別配制濃度2%、4%、6%、8%、10%的樣品溶液，取相同體積加入裝有35 g硅膠的層析柱中，經乙酸乙酯與甲醇（體積比為4∶1）的混合溶劑洗脫后，分別收集柱后洗脫液，測定各自神經節苷酯含量，計算其回收率。

1.3.3.3 洗脫劑影響

洗脫劑對粗提物的洗脫效果，決定其柱后洗脫液中待測組分的回收率，因此采用薄層色譜法選擇對粗提物中神經節苷脂具有良好分離效果的洗脫劑。吸取相同體積的樣品溶液點樣至硅膠板后，揮干溶劑，分別放入不同配比洗脫劑的燒杯內，待洗脫劑展開至板端1 cm處取出，揮干溶劑，顯色，以標準品作對照，計算目標化合物在不同配比的洗脫劑中比移值。

1.3.4 響應面試驗

在單因素試驗基礎上，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken試驗設計原理[11-12]，以硅膠用量（A）、上樣濃度（B）、洗脫劑配比（C）為響應因素，回收率（Y）為響應值，進行三因素三水平的響應面（response surface methodology，RSM）分析試驗，確定豬腦組織中神經節苷酯粗提物的最佳純化工藝。

1.3.5 定量分析方法

神經節苷脂中含唾液酸的寡糖鏈易與間二苯酚-鹽酸溶液反應生成藍紫色化合物，在可見光區具有最大吸收[13]，因此采用移液槍精密移取100 μg/mL唾液酸標準溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 于 5 mL 具塞試管中，隨后加入間二苯酚-鹽酸溶液2 mL，振搖后置于100℃沸水加熱15 min，隨后冷卻加入4 mL異戊醇，離心取上層有機相，于620 nm最大吸收波長處測定各自吸光度，繪制唾液酸濃度（X）-吸光度（Y）的標準曲線，線性方程為：y=1.765 x-0.262（r=0.992 1），表明唾液酸濃度在10 μg/mL～50 μg/mL時，吸光度與其線性關系良好。

按校準曲線測定步驟，測定樣品的吸光度A，根據校準曲線和吸光度計算唾液酸含量，進而計算樣品溶液中神經節苷酯含量。

2 結果與討論

2.1 粗提物含量

異戊醇作空白對照，精密稱取神經節苷脂粗提物0.5 g，按照1.3.5所述測定方法于620 nm波長處測定吸光度，平行測定3次，代入校準曲線方程，計算粗提物中神經節苷脂的含量，結果見表1所示。

表1 粗取物中神經節苷脂含量Table 1 The content of gangliosides of crude extract

2.2 單因素試驗分析

2.2.1 硅膠用量分析

層析柱內裝載不同質量的硅膠對粗提物中神經節苷脂的回收率影響，見圖1所示。

從圖1可見，隨著硅膠用量增多，產物中神經節苷脂的含量不斷增大，但繼續增大硅膠用量，回收率則逐漸下降，這歸因于神經節苷脂在硅膠中殘留量逐漸增大，因此選擇30、35、40 g作為硅膠用量的響應因素水平。

圖1 硅膠用量影響Fig.1 The effect of slica amount

2.2.2 上樣濃度分析

上樣濃度對粗提物中神經節苷脂的回收率影響，見圖2所示。

圖2 上樣濃度的影響Fig.2 The effect of gangliosides concentration in crude extract

從圖2可見，隨著上樣濃度增大，產物中神經節苷脂的含量不斷下降，而回收率卻不斷增加。這歸因于固定的硅膠用量下，增加上樣濃度，目標化合物在硅膠的殘留比逐漸降低，從而回收率提高，但由于其和部分雜質洗脫時間重疊，使得產物的含量逐漸下降，因此選擇4%、6%、8%作為上樣濃度的響應因素水平。

2.2.3 洗脫劑配比分析

表2為不同配比的洗脫劑洗脫目標化合物的比移值。

表2 不同體積的乙酸乙酯與甲醇在薄層色譜層析（thin-layer chromatography，TLC）中比移值（Rf）Table 2 The Rfvalue of ethyl acetate and methyl alcohol in different volume on TLC

從表2中可見，當洗脫劑為乙酸乙酯與甲醇（V∶V=4∶1），分離效果最佳，因此選擇乙酸乙酯與甲醇體積比3∶1、4∶1、5∶1作為洗脫劑配比的響應因素水平。

2.3 響應面法分析

根據單因素試驗結果，各響應因素水平見表3所示。表4為試驗設計方案與響應結果。

表3 響應面分析因素及水平Table 3 Factors and levels of response surface design

表4 Box-Behnken設計方案及結果Table 4 Design and results of the Box-Behnken

對表4結果多元回歸擬合，得到以回收率為目標的函數，關于各參數編碼值的二次回歸方程為：R=83.8-0.57A+2.24B+0.54C+0.007AB+0.45AC-0.075BC-2.81A2-1.24B2+0.36C2，對各參數進行方差分析，見表5所示。

從表5可知，該回歸模型P＜0.01，表明其對粗提物中神經節苷脂的回收具有較好預測性，同時R2=0.943 7與R2Adj=0.871 4都接近于1，表示該模型可靠性較高，而變異系數＜1%，可知其它因素對響應值的影響較小，因此該回歸方程可替代實際值對試驗結果進行分析。一次項B對神經節苷脂的回收率影響顯著，二次項A2、B2對試驗結果影響顯著，而交互項影響均不顯著。從F值可知，影響神經節苷脂的回收率強弱順序為：上樣濃度＞硅膠用量＞洗脫劑配比。

表5 回歸方程方差分析Table 5 Variance analysis for the fitted regression mode

2.4 響應面模型分析

圖3反映不同兩因素交互作用的響應面，其中曲面越大代表二者交互作用越大[14]，在中心點附近回收率愈高[15]。通過解二次多項回歸擬合方程得到最優條件為：將質量濃度7.75%的粗提物樣品溶液，以2.5 BV/h流速上樣至裝有34.89 g硅膠的層析柱后，采用乙酸乙酯與甲醇（體積比為4∶1）的混合溶劑以2.0 BV/h流速洗脫，預測產物中神經節苷脂的最大回收率為86.7%。

圖3 不同兩因素交互作用響應面Fig.3 Response surface of different two factors interaction

2.5 驗證試驗

為驗證響應面法所得最佳純化工藝的可實施性，將質量濃度為7.75%的樣品溶液，以2.5 BV/h流速上樣至裝有34.89 g硅膠的層析柱后，采用乙酸乙酯與甲醇（體積比為4∶1）的混合溶劑，以2.0 BV/h流速洗脫，收集洗脫液，定量分析神經節苷脂的含量，結果見表6所示。

表6 純化后產物的神經節苷脂含量Table 6 The content of gangliosides in product after purification

通過表6所得純化后產物的神經節苷脂含量，計算得出神經節苷脂的回收率為86.9%，與預測值較為接近，表明采用響應面法得到的工藝參數準確可靠，對相關工業生產具有一定指導作用。提取物中神經節苷脂含量由純化前12.23%提高至純化后35.32%，為純化前的2.89倍。

3 結論

本研究采用硅膠柱層析法純化豬腦組織粗提物中神經節苷脂，利用響應面法優化得到最佳純化工藝條件：將質量濃度為7.75%的樣品溶液，以2.5 BV/h流速上樣至裝有34.89 g硅膠的層析柱后，采用乙酸乙酯與甲醇（體積比為4∶1）的混合溶劑以2.0 BV/h流速洗脫，洗脫產物中神經節苷脂回收率為86.9%，目標化合物含量為純化前的2.89倍。該工藝操作簡便、純化效率較高，適合推廣于相關工業應用。