IL-6、STAT3及P-STAT3在口腔黏膜下纖維性變各期中的表達研究*

李鵬程,鄭根建,云 蔓,何 龍

(海南醫學院第一附屬醫院口腔科，海口 570102)

口腔黏膜下纖維性變又稱口腔黏膜下纖維化(oral submucous fibrosis，OSF),是一種慢性、隱匿性、具有癌變傾向的口腔黏膜疾病[1]。OSF主要病理特征包括早期黏膜固有層及黏膜下層膠原纖維堆積，隨后形成致密的膠原纖維束，晚期伴不同程度的玻璃樣變及上皮組織萎縮。OSF的具體發病機制并不明確，但咀嚼檳榔導致成纖維細胞纖維化、自身免疫反應等因素是目前國內外公認的致病因素之一。OSF最大的危害在于具有癌變傾向，WHO已將OSF定義為癌前病變[1-4]。

1 資料與方法

1.1一般資料 根據pindborg病理學標準收集海南醫學院第一附屬醫院2016年1月至2017年12月就診且確診的35例OSF患者，由3名病理科醫師光鏡下對病例進行分期，其中早期9例、中期14例、晚期12例。同時選擇正常口腔黏膜組織35例，組織樣本采集均經過海南醫學院第一附屬醫院倫理學委員會批準，患者均簽署知情同意書。患者性別、年齡見表1。各期診斷標準，OSF早期：口腔黏膜有燒灼感，進食時有刺激痛，檢查見局灶性或散在性口腔黏膜灰白色改變，質地無改變或粗糙，開口度大于或等于30 mm;OSF中期：進刺激性食物時口腔黏膜疼痛，黏膜顏色呈片狀灰白色改變，質地變硬，翼下頜韌帶及軟腭捫及纖維條索，張口度為20～30 mm;OSF晚期：進刺激性食物時口腔黏膜疼痛，黏膜顏色呈灰白色改變，質地變硬，捫診呈板狀或皮革樣，舌運動受限，伸舌困難，病變侵及口咽及咽喉部，張口度小于20 mm。

1.2試劑 OSF臨床標本均由海南醫學院第一附屬醫院口腔科提供，胎牛血清購自美國PAA公司，Trizol購自美國Invitrogen公司，RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、 熒光定量PCR試劑盒均購自日本Takara公司，IL-6、STAT3、p-STAT3兔單克隆抗體均購自美國Abcam公司，寡核苷酸鏈由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，所用的寡核苷酸序列見表2。

表1 患者性別、年齡及分期

表2 引物序列

1.3方法

1.3.1免疫組織化學 將兩張OSF切片常規脫蠟至水，常溫下滴加3%過氧化氫甲醇溶液于標本切片上孵育10 min，消除內源性過氧化物酶的活性，PBS液在搖床上洗3次，每次2 min；將兩張切片置于盛有枸櫞酸溶液的高壓鍋內加熱，待高壓鍋排氣管排氣后調低火，繼續加熱2 min，自然冷卻至室溫，PBS液在搖床上洗3次，每次2 min；5%BSA封閉液室溫孵育30 min，以減少一抗非特異性結合；分別加入兔來源的IL-6、STAT3一抗(1∶200)，4 ℃過夜，PBS液搖床上洗3次，每次2 min；標本切片上滴入生物素化山羊抗兔二 抗，37 ℃恒溫箱內孵育30 min，PBS液搖床上洗3次，每次2 min；加入鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復合物室溫下孵育20 min，PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色2～3 min，自來水沖洗，蘇木素復染標本切片6 s；切片經梯度乙醇脫水干燥，并經二甲苯透明后中性樹膠封固。棕褐色反應物顆粒狀或彌散性分布在細胞核為IL-6、STAT3、P-STAT3陽性表達。

1.3.2RT-PCR測定 因患者病理分期數目不同，無法取統一整數比較，故取正常組織9例及早、中、晚期OSF 組織各9例(共27例)，用Trizol一步法提取組織中的總RNA，Qubit Fluorometer檢測RNA水平及純度，按反轉錄試劑盒說明將總RNA逆轉錄為cDNA,用RT-PCR檢測相關基因。

1.3.3Western blot 取正常組織4例及早、中、晚期OSF 組織各4例(共12例)，RIPA裂解液裂解混勻，4 ℃ 16 000 r/min離心20 min，吸取上清液棄沉淀，考馬斯亮藍法檢測組織樣本蛋白濃度，樣本凝膠電泳后浸泡于轉移緩沖液中15 min，裝配轉移“三明治”120 V，35～55 min，用TBS漂洗膜10～15 min，置于封閉液中室溫搖動2 h，4 ℃過夜，之后常規加入IL-6、STAT3、P-STAT3一抗室溫孵育2 h，與之相應的兔抗人二抗室溫孵育1 h。采用Quantity One v4.62軟件分析條帶灰度值，并做統計分析。

2 結 果

2.1免疫組化 OSF患者免疫組化染色切片顯示，OSF組織內可見呈棕褐色的STAT3、IL-6、P-STAT3陽性細胞(圖1)。

2.2RT-PCR IL-6及P-STAT3在各期OSF組織中的mRNA表達量OSF晚期最高(P<0.05)；STAT3在對照組及各期OSF組織中的表達量，差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

2.3Western blot IL-6及P-STAT3在各期OSF組織中的蛋白表達灰度值較對照組織顯著升高，STAT3在各期OSF組織中的蛋白灰度值較對照組無明顯變化，見圖3。

A：OSF STAT3陽性細胞(棕褐色)；B:OSF IL-6陽性細胞(棕褐色)；C:OSF P-STA3陽性細胞(棕褐色)；D:陰性細胞

圖1 OSF結締組織免疫組化染色切片

a：P<0.05

圖2 STAT3、IL-6、P-STAT3 mRNA表達差異分析

圖3 STAT3、IL-6、P-STAT3蛋白表達情況

3 討 論

口腔黏膜下纖維性變主要的臨床癥狀有口腔黏膜蒼白、僵硬，張口受限，不能進食熱、辣食物等，突出的病理特征是口腔黏膜固有層大量膠原堆積。上皮下膠原的過度累積和玻璃樣變是OSF患者口腔黏膜發生不可逆改變并致張口困難的重要原因和重要特征之一，其本質是成纖維細胞和肌纖維母細胞等產生膠原蛋白等過多沉積于黏膜上皮下所致，如何防止這一過程的發生和發展仍是當今OSF治療的重大挑戰[5]。但是黏膜下纖維化是一個極其復雜的病理生理過程，迄今為止關于OSF上皮損傷、膠原的過度沉積和血管病變形成和發展機制尚不明確，導致沒有直接針對OSF有效的治療方法。因此探索其形成機制和阻斷辦法具有重要的理論和實際意義。由于OSF發生、發展的機制尚不明確,使得OSF在過去30年中嘗試的大多數化學預防性或其他系統性醫療方法仍然是不佳的。OSF當前的治療方法可分為3種：物理治療、手術治療和藥物治療，但是治療效果都無法令人滿意。單純的營養補充或行為干預，對纖維化程度沒有任何改善[6-9]。

白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是一種主要由單核巨噬細胞、靜止的T細胞、B細胞等產生的具有多種生物功能、廣泛免疫調節功能的細胞因子[10-11]，它在許多疾病中都被檢測到表達升高，如：類風濕關節炎、銀屑病、自身免疫性疾病等[12-13]。IL-6作為一種細胞趨化因子，其中主要參與機體的纖維化形成和炎性反應，其抑制細胞外基質分解，使膠原蛋白聚集增加，促進成纖維細胞增殖，從而使組織纖維化。

STAT3屬于STAT家族(signal transducer and activator of transcription factors)重要成員之一，即信號轉導及轉錄活化因子3，STAT3功能結構域主要包括：N-末端結構域、螺旋-螺旋結構域、DNA結合結構域、連接子結構域、SH2結構域及C-末端的激活區[14]。SH2結構域是STAT3最保守和功能最重要的部分，主要介導STAT3與其他磷酸化酪氨酸蛋白的耦聯，形成STAT3二聚體，從而激活該通路[15]。細胞因子如IL-17與跨膜受體結后，激活受體耦聯的JAK，在STAT3與磷酸化的受體結合后，誘發STAT3的C-末端Tyr-705磷酸化[16]。磷酸化的STAT3從受體上解離，并通過SH2結構域相互作用，形成P-STAT3二聚體，P-STAT3二聚體與PIAS結合阻斷P-STAT3二聚體與DNA結合部位，進而負反饋調控STAT磷酸化作用[17]。近年來有研究報道，磷酸化的STAT3(p-STAT3)的異常表達在銀屑病發生中起重要作用，并認為與黏膜或皮膚的纖維化等行為相關。

本研究通過免疫組化、RT-PCR、Western blot對正常口腔黏膜組織及各期OSF組織中的IL-6、STAT3、P-STAT3進行檢測，免疫組化實驗表明在口腔黏膜發生纖維性變的結締組織內IL-6、STAT3呈陽性表達，RT-PCR及Western blot實驗表明，IL-6、P-STAT3在OSF組織中早期、中期表達較正常黏膜組織無顯著升高，晚期較正常黏膜組織表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，STAT3在各期OSF組織中表達較正常組織無顯著升高，差異無統計學意義(P>0.05)。

綜上所述，在OSF組織中，IL-6的表達隨著病變從早期向晚期的發展呈顯著性升高，然后誘導下游信號通路分子STAT3的磷酸化，即P-STAT3表達增加，由此說明，IL-6可以通過激活信號通路STAT3的磷酸化同時促進口腔黏膜組織纖維化由早期向晚期的轉變，該結果表明，IL-6和P-STAT3在OSF發生、發展過程中可能起到促進的作用，這為臨床治療OSF提供了新的關鍵靶點。