多孔納米羥基磷灰石的制備及藥物緩釋性能

劉露露，錢功明，徐作行

（武漢科技大學資源與環境工程學院，湖北武漢 430081）

與直接給藥相比，藥物緩釋具有副作用小，有效作用時間長等優點，也一直是醫藥領域的研究熱點[1，2-5]。藥物緩釋劑由藥物和藥物載體制備而成，而藥物載體對藥物緩釋劑的緩釋性能起決定作用。常用于制備藥物載體的材料有合成高分子有機材料、殼聚糖、膠原材料、納米纖維素載體、二氧化鈦-二氧化硅無機材料等[6，7-8]，其中無機材料具有很好的藥物負載能力，但生物相容性差。

羥基磷灰石（HAP）是生物體硬組織的主要組成部分，具有良好的生物相容性、強吸附能力、高生物降解能力、安全無毒等優點，適合用作藥物載體。而HAP作為藥物載體是目前的研究熱點[9，10-11]。已有研究發現，比表面積越大、孔隙越多HAP的HAP負載和藥物緩釋效果越好[12-13]，因此，制備高比表面積多孔HAP是目前HAP藥物載體的發展趨勢。

為了制備藥物負載性能與藥物緩釋性能良好的HAP，采用羧甲基纖維素鈉（CMC）作為模板劑，制備高比表面積的三維多孔納米HAP，并考察陳化溫度、磷源溶液的初始pH等因素對HAP形貌結構及其成分的影響；并用制備得到的HAP作為藥物載體制備AM-HAP藥物緩釋劑，進行體外緩釋，考察PBS溶液的pH對AM-HAP緩釋行為的影響，并對藥物緩釋機理進行分析。

1 實驗

1.1 原料與儀器

實驗用主要試劑：硝酸鈣（Ca（NO3）2）、磷酸二氫銨（NH4H2PO4）、濃氨水（NH3·H2O）、CMC（C8H11O5Na）、氫氧化鈉（NaOH）、濃鹽酸（HCl）、AM（C16H19N3O5S·3H2O）、 磷酸氫二鈉（NaHPO4）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）、氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl）等，均為分析純。實驗中所用的水均為蒸餾水。

實驗用儀器設備：UV-1100型紫外-可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；FA-1004型電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；DZF-6050型真空干燥箱、HJ-4型多頭磁力加熱攪拌器，江蘇常州國華電器有限公司；SZ-93型自動雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；800低速電動離心機，金壇市易晨儀器制造有限公司；X射線衍射（XRD）儀，XD-5A型，日本島津，Cu靶Kα，管電壓為35 kV，管電流為35 mA，接收狹縫為0.3 mm；掃描電鏡（SEM）和X射線能譜（EDS）儀，JSM-5510型，日本島津；馬弗爐，武漢電廬實驗電爐廠。

1.2 HAP制備方法

使用蒸餾水配置濃度為1 mol/L硝酸鈣溶液、0.6 mol/L磷酸二氫銨溶液和質量濃度為6 g/L的羧甲基纖維素鈉溶液。將250 mL的CMC溶液加入球磨機中球磨30 min；再繼續向球磨機中加入75 mL的硝酸鈣溶液，球磨30 min，即得混合液；將此混合液從球磨機移入500 mL燒杯中，在磁力加熱攪拌器中邊攪拌邊緩慢向混合液中加入75 mL磷酸二氫銨溶液與不同體積的濃氨水的混合溶液，得HAP的前驅體；將前驅體從燒杯移入球磨機，球磨30 min，從球磨機中移入封閉容器內，在不同溫度下陳化24 h后放入離心機中固液分離，放入烘箱干燥48 h后，在700℃條件下焙燒處理2 h。

1.3 AM-HAP制備方法

將AM溶于濃度為0.1 mol/L的鹽酸溶液，配置成AM溶液，并調節溶液pH為10。取50 mLAM溶液于250 mL燒杯中，加入0.05 g以1.2所述方法制備的HAP，攪拌一段時間，離心后常溫干燥，即可得到AM-HAP。

1.4 AM-HAP的體外緩釋實驗方法

用蒸餾水配置PBS溶液，分別取15 mL不同pH的PBS溶液于離心管中，然后向其中加入0.02 g AM-HAP，在37℃條件下，每間隔一定時間，從離心管中取出3 mL上清液，并立即向其中補充加入3 mL相對應pH的PBS溶液，采用紫外分光光度法測定上清液中AM的濃度。

2 結果與討論

2.1 陳化溫度對HAP形貌結構的影響

在焙燒溫度為700℃，焙燒時間為2 h，升溫速度為10℃/min，CMC與HAP的質量比為20%，加入的磷酸二氫銨溶液的pH為10.2，其他實驗條件相同的條件下，改變陳化溫度，分別在 284.16、303.16、333.16、353.16 K條件下進行陳化，探討陳化溫度對HAP的結構及成分的影響。圖1為不同陳化溫度下HAP的XRD圖譜。

圖1 不同陳化溫度下HAP的XRD圖譜Fig.1 XRD patterns of HAP of different aging temperature

由圖1可以看出，陳化溫度為284.16 K時，產物的主要成分為HAP和磷酸鈣（Ca3（PO4）2，TCP），含雜質較多，其中TCP的衍射峰尖銳，HAP的衍射峰較寬；陳化溫度為303.16、333.16、353.26 K時，產物的主要成分為純HAP，衍射峰較寬且基本沒有變化，由此可知HAP結晶度不高，而陳化溫度對HAP的結晶度影響不大。綜上所述，當陳化溫度較低為284.16 K時，有雜質TCP生成，而陳化溫度較高時，則生成純的HAP。分析其原因是：NH3·H2O是弱電解質，電離吸熱，電離式如式（1）所示[15]，當溫度降低時，平衡向左移動，溶液中OH-離子濃度下降，合成溶液的堿性度降低，從而參與HAP合成反應的OH-離子不足，生成雜質Ca3（PO4）2。因此，陳化溫度對HAP的化學組成有很大影響，溫度過低時，有Ca3（PO4）2雜質生成。

圖2為不同陳化溫度下反應前后溶液的pH。由圖可以看出，溶液的初始pH均為10.2。當陳化溫度為301.16 K時，陳化后溶液的pH為9.37～9.44；而當陳化溫度為294.16 K時，陳化后溶液的pH為9.55～9.66。由此可知，陳化溫度對陳化后溶液的pH有很大影響，陳化后溶液的pH隨陳化溫度的升高而減小。而從圖1已知，陳化溫度低時，弱電解質NH3·H2O的電離平衡向左移動，參與HAP合成反應的OH-離子濃度下降。

綜上表明，陳化溫度降低，NH3·H2O電離平衡向左移動，參與反應的OH-離子濃度下降，因此陳化溫度降低時陳化后溶液中OH-離子的殘余濃度增大，即陳化溫度降低，陳化后溶液pH增大。除以上原因外，陳化后溶液pH隨溫度升高而減小的原因還可能是：溫度升高，NH3·H2O以氨氣（NH3）的形式揮發了，但由于陳化容器有一定密閉性，因此這一因素對pH的影響較弱。綜上，陳化溫度會影響HAP的化學組成，溫度降低時，參與反應的OH-離子濃度下降，生成雜質TCP，反應后溶液中殘余的OH-離子濃度升高，溶液pH增大。

圖2 不同陳化溫度下反應前后溶液的pHFig.2 pH of solution before and after experiments of different aging temperature

圖3 為不同陳化溫度下HAP的SEM圖像。圖4為不同陳化溫度下HAP的粒徑。由圖可以看出，不同陳化溫度下，HAP均為三維多孔結構，而HAP的粒徑在不同的陳化溫度時有很大變化。由圖4可以看出，隨著陳化溫度的升高，HAP的粒度逐漸變小。陳化溫度為284.16 K時，顆粒粒徑為249.55 nm，而當溫度升高到353.16 K時，顆粒粒徑減小為64.84 nm。這是因為：溫度對CMC的性能有很大影響[14]，CMC的溶脹性隨溫度的升高而增大。CMC在溫度293.16 K以下時，溶脹性會迅速減小，而在溫度353.16 K時可使其CMC膠體變性，溶脹性顯著增大，而CMC溶脹性變大會導致HAP生長的空間位阻增大。

結合圖3和圖4分析，溫度為284.16 K時，CMC溶脹性低，CMC分子空間位阻小，其分子間的空隙大，HAP生長成大尺寸的片狀，如圖3a所示；溫度為301.16、303.16 K時，CMC溶脹性較好，空間位阻較大，其分子間的空隙較小，HAP生長成小尺寸的棒狀、支架狀，如圖3b、c所示；當溫度過高，為333.16、353.16 K時，CMC膠體變性，溶脹性顯著增大，CMC分子空間位阻過大，分子間的空隙過小，HAP生長成小尺寸的粒狀并且發生團聚，如圖3d、e所示。

圖3 不同陳化溫度下HAP的SEM圖像Fig.3 SEM of HAP of different aging temperature

圖4 不同陳化溫度下HAP顆粒的粒徑Fig.4 size of HAP of different aging temperature

2.2 pH對HAP形貌結構的影響

在焙燒溫度為700℃，焙燒時間為2 h，升溫速度為10℃/min，CMC與HAP的質量比為20%，且加鈣源后球磨時間為30 min，反應及陳化溫度為301.16 K，其他條件相同的條件下，改變磷酸二氫銨溶液的 pH，pH 分別為 9.2、9.6、10.0、10.2。探討 pH對HAP形貌結構的影響，圖5為不同初始pH的HAP的XRD圖譜，表 1為不同初始pH時HAP的化學組分。

綜上所述，增強MRI對結直腸癌患者發生淋巴結轉移的檢出率及診斷準確率較高，可有效顯示結直腸癌MRI圖像特征，為臨床制定治療方案提供影像學資料。

表1 不同pH制備的HAP的化學組分Tab.1 chemical constitution of HAP of different initial pH

從圖5可以看出，pH為10.2時，產物的成分為HAP，不含其他副產物，衍射峰較寬，結晶度不高；而pH小于10.2，pH為10.0、9.6和9.2時，得到的主要產物為HAP和TCP，副產物含量較高，其中TCP的衍射峰尖銳，HAP的衍射峰較寬。

圖5 不同初始pH下HAP的XRD圖譜Fig.5 XRD spectrum of HAP of different initial pH

從表1可以看出，當pH為9.2時，TCP的質量分數為48%；pH為10.2時，TCP的含量為0時。TCP的含量隨pH的增大而減小，當pH達到10.2時，成品為純HAP。分析其原因為：當pH小時，參與HAP合成反應的OH-離子不足，到反應后期，反應溶液從堿性變成酸性，反應生成TCP；而隨著pH的增大，參與HAP合成反應的OH-離子增多，反應生成的副產物TCP逐漸減少；當pH為10.2時，反應溶液始終保持在堿性狀態下，因此沒有副產物生成，生成物為純的HAP。圖6所示為不同pH條件下陳化后溶度的pH。

圖6 不同pH條件下陳化后溶液的pHFig.6 pH of the solution of different initial pH after aging

從圖6可以看出，當pH為9.6和9.2時，陳化后溶液的pH小于7，這表明pH較小時，HAP合成反應后期，鈣磷溶液處于酸性環境中，生成TCP。而當pH為10.0時，陳化后溶液的pH為8.5，即OH-離子濃度為10-5.5mol/L，這說明在HAP合成反應過程中，反應溶液始終處于堿性環境中，但此時仍然生成了19%的TCP。分析可能的原因是：OH-離子濃度較小時，Ca2+、PO43-和OH-的溶度積小于HAP的溶度積常數Ksp1，不能生成HAP，而 Ca2+和PO43-的濃度積大于TCP的溶度積常數Ksp2，因此生成了副產物TCP，如式（2）和（3）所示。由此可知，當反應溶液始終處于堿性環境，且 Ca2+、PO43-和 OH-濃度關系始終滿足式（4）和（5）時，生成純HAP，沒有副產物。即當pH為10.2時，陳化后的pH為9.4，當OH-的濃度為10-4.6mol/L時，Ca2+、PO43-和 OH-的濃度關系始終滿足式（4）和（5），合成產物為純HAP。

式中，C 表示物質的量濃度，Ksp1、Ksp2分別為 TCP、HAP的濃度積常數。

為進一步探究pH對HAP的形貌的影響，對制得的HAP進行掃描電鏡，圖7為不同pH條件下HAP的SEM圖像，圖8為不同pH條件下HAP的粒徑。

從圖7中可看出，pH為9.2和9.6時，產物粒度不均勻；pH為10.0和10.2時，合成的產物粒度均一。pH為9.6、10.0和10.2時，合成的產物互相連接在一起，形成多空隙的架狀結構。其中pH為9.6和10.0時，產物為大尺寸的塊狀和片狀，且顆?；ハ鄨F聚連接成一個整體；而pH為10.2時，HAP為細長的棒狀，棒與棒互相連接成多孔的三維結構。

圖7 不同pH條件下HAP的SEM圖像Fig.7 SEM of HAP of different initial pH

圖8 不同PH條件下HAP的粒徑Fig.8 size of HAP of different initial pH

從圖8可以看出，pH為9.6和9.2時HAP的粒徑較大，分別為334、240 nm，且粒度尺寸非常不均一，小顆粒尺寸分別為108、101 nm。而pH為10.0和10.2時，HAP的粒徑均一，粒徑較小，分別為129、134 nm。出現這種情況的原因是：溶液的pH對CMC的溶脹性影響很大。當pH為7時，相同濃度下CMC溶液的溶脹性最低，并且CMC溶液在酸性環境時的溶脹性比在堿性環境中的溶脹性低。而CMC的溶脹性越大，空間位阻增大，合成的HAP粒徑越小，而由圖8可知，pH為9.6和9.2時，陳化后溶液的pH分別為7和5，在此pH下CMC溶液溶脹性低，合成的HAP粒徑大；而溶液初始pH為10.0、10.2時，陳化后溶液的pH為8.3、9.5，此時CMC溶液溶脹性大，因此合成的HAP粒徑小。

2.3 PBS溶液的pH對AM-HAP緩釋行為的影響

圖9 不同pH的PBS溶液下AM-HAP的緩釋Fig.9 relationship between the concentration of AM and the reaction time in the pH 7.4 and pH 5.7 of PBS liquid

表2 不同pH條件下PBS溶液中AM的脫附率Tab.2 desorption efficiency of AM in different pH of PBS liquid

由表2可知，AM的脫附率隨著PBS溶液pH的降低而增大，由此可知AM-HAP有一定的選擇脫附能力。從圖9可以看出，在pH為7.4時，從緩釋初期開始AM濃度始終維持在一個穩定的范圍，在1 mg/L左右浮動。而當緩釋時間達到150 h時，AM濃度開始下降，緩釋行為結束，此時AM的脫附率為56.6%。而在pH為5.7時，AM的濃度隨緩釋時間的延長呈M型變化。在緩釋前1.5 h內AM濃度隨時間的延長而增大，并且在此過程中AM的脫附率達到48.3%；在1.5～10 h，AM的濃度持續降低；在10～24 h時，AM的濃度隨時間延長而增大，并且在之后的24～190 h，AM的濃度始終保持穩定，在1.5～2.5 mg/L左右浮動，且緩釋結束后，AM的總脫附率達到92.8%。

綜上可知，AM-HAP有選擇性緩釋性能，與pH為7.4時的PBS溶液中緩釋相比，在pH為5.7時的PBS溶液中，AM的脫附率達到92.8%，且能夠長時間維持AM濃度在一個穩定的范圍。這是因為，pH為5.7時，溶液中的H+離子濃度高，而AM與HAP的結合是通過AM分子中的羧基脫去H+，AM中的帶負電荷官能團靜電吸附在HAP的特殊吸附點位上，因此H+離子濃度的增大會促使AM中的—COO-與H+離子結合成—COOH，從而使AM從HAP的吸附位點上脫附并進入PBS溶液中，提高AM的濃度。而AM濃度隨時間呈M型變化則是因為：緩釋前期，吸附在HAP表面和表面孔隙中的AM由于H+的促進作用，很容易脫附進入溶液，因此在前期1.5 h的AM脫附率就與pH為7.4時的總脫附率相差不大。這說明pH為7.4的整個緩釋過程和pH為5.7緩釋的前1.5 h，均屬于HAP表面和表面孔隙中的AM的脫附；而pH為5.7時的緩釋后期AM的濃度又開始升高并維持穩定，則是因為HAP的表面結構在酸性環境中溶解，使HAP內層結構暴露于表面，且負載在其中的AM也隨之脫附進入溶液，AM濃度增大并維持穩定。綜上所述，pH為5.7時的PBS溶液中緩釋過程為：HAP表層AM脫附—HAP表面溶解—HAP內層AM脫附。

為進一步研究PBS溶液的pH對AM脫附的影響，證明以上結論，對緩釋后的殘余固體做掃描電鏡和能譜，如圖10所示，為緩釋后AM-HAP殘余固體的SEM圖像和EDS能譜圖。

由圖10可以看出，緩釋結束后，pH為5.7時AM-HAP表面明顯發生溶解，如圖10a所示，HAP表面凹凸不平。這是因為HAP與溶液中的H+反應，HAP表面溶解，進一步證明PBS溶液的pH為5.7時的緩釋過程中，HAP表面溶解是重要步驟。如圖10c—f所示，緩釋后HAP表面specterm1的位置為溶解后的表面，其能譜圖中沒有C元素的峰，這說明HAP表面溶解后AM脫附完全；而specterm2的位置為HAP表面尚未溶解或溶解較弱的位置，如10f所示，有較強的C元素峰出現，說明此處還有少量未脫附的AM。而如圖10b所示，pH為7.4的反應后殘余固體表面基本沒有發生溶解。

圖10 緩釋后AM-HAP殘余固體的SEM圖像和EDS能譜圖Fig.10 SEM and EDS of the final residual solid of AM-HAP after reaction

3 結論

采用模板法制備三維多孔納米HAP，陳化溫度和溶液的初始pH對HAP的形貌、結構和化學組成有很大影響。陳化溫度升高，NH3·H2O電離平衡向右移動，參與反應的OH-離子增多，生成純HAP。而陳化溫度降低，參與反應的OH-離子不足，生成雜質TCP。CMC的溶脹性隨陳化溫度的升高而增大，因此陳化溫度越高，HAP的粒徑越小。溶液的初始pH小于10.2時，參與HAP合成反應的OH-離子不足，生成雜質TCP；而當初始pH為10.2時，生成純的HAP。溶液酸堿度對CMC的溶脹性有很大影響，堿性時CMC的溶脹性比酸性時的溶脹性大。因此pH為9.6時，HAP為片狀粒徑為334 nm，而pH為10.2時，HAP為細長棒狀長為134 nm。

以本文中的制備方法制備的HAP作為藥物載體，制得的AM-HAP具有很好的緩釋性能及選擇性脫附性能。在pH為7.4的PBS溶液中能持續緩釋150 h，并且AM的濃度維持穩定，AM的總脫附率為56.6%。pH為7.4時的PBS溶液中緩釋過程為：AM中的—COO-與H+離子結合成—COOH，從而使AM從HAP的吸附位點上脫附并進入PBS溶液；在pH為5.7的PBS溶液中，AM的濃度隨緩釋時間的延長呈M型變化，緩釋前1.5 h的AM的脫附率就達到48.3%。pH為5.7時的PBS溶液中緩釋過程為：HAP表層AM脫附—HAP表面溶解—HAP內層AM脫附。