長鏈非編碼 RNA UCA1對微衛(wèi)星不穩(wěn)定的人類結(jié)腸癌細胞侵襲和遷移能力的影響

徐晉珩 劉麗云 鄢麗敏 張志勇 夏慶安 王正暉

(唐山市工人醫(yī)院病理科，河北 唐山 063000)

目前人類結(jié)腸癌的患病率日益增長的趨勢已得到廣泛共識，并且研究表明它在腫瘤世界范圍內(nèi)的排行為第三位〔1〕，據(jù)我國學(xué)者統(tǒng)計，在國內(nèi)發(fā)病率較高的前五類腫瘤，其中就有結(jié)直腸癌〔2〕。隨著人類對自身機體是否處于良好狀態(tài)的要求有所提高，因此對于腫瘤的剖析也需要提高到一定層次。長鏈非編碼RNA(lncRNA)的特點是：長度由200個以上的核苷酸組成〔3〕，并且它的開放式閱讀框是不完整且沒有特異性的，是一種極少有蛋白編碼功能的非編碼RNA〔4〕。有學(xué)者提出〔5〕，lncRNA的異常表達在腫瘤發(fā)生及癌癥相關(guān)性方面能夠誘導(dǎo)或加速其病理改變病情進展。近年更有研究表明lncRNA在基因表達過程中是關(guān)鍵調(diào)控分子，相關(guān)靶基因的表達調(diào)控在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后等多種水平有重要體現(xiàn)。結(jié)腸癌的研究進展中，一些文獻報道了有關(guān)不同類型的lncRNA表達異常時發(fā)揮的作用，如促進癌細胞的增殖〔6～8〕、遷移〔9，10〕和侵襲能力〔11，12〕，抑制癌細胞凋亡及在細胞周期方面的影響力〔13〕。隨著人類對腫瘤學(xué)的認知不斷深入，lncRNA的種類被更多的發(fā)現(xiàn)，有學(xué)者得出在一些腫瘤類型中，差異性表達存在于腫瘤組織與其相鄰的正常組織間的結(jié)論〔14〕。lncRNA尿路上皮癌胚抗原(UCA)1在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中有一定的作用，表明它有一定的致癌作用，對結(jié)直腸癌而言說明了UCA1對其細胞周期的作用為負調(diào)節(jié)，與細胞凋亡呈負相關(guān)〔15，16〕。基于近幾年的研究，有報道稱發(fā)現(xiàn)了與結(jié)腸癌發(fā)病有密切關(guān)聯(lián)的因素，這個重要角色的扮演者就是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，研究還表明結(jié)腸癌患者發(fā)病起到關(guān)鍵作用的正是微衛(wèi)星不穩(wěn)定的癌細胞〔17～19〕。本研究旨在檢測lncRNA UCA1在微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)腸癌細胞中的水平，進而分析其對結(jié)腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1時間及地點 實驗于2015年12月至2016年5月在河北醫(yī)科大學(xué)實驗室完成。

1.2主要材料及來源 人結(jié)腸癌細胞LoVo系、正常結(jié)腸細胞HUM-CELL-0033(均由河北醫(yī)科大學(xué)細胞研究中心提供)10%胎牛血清(上海卡奴生物科技有限公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、RT-PCR 試劑盒(TaKaRa公司)；LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)、siRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；無血清RPMI1640培養(yǎng)液、Transwell(武漢博士德生物有限公司)；兔抗人MSH2與MSH6單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)，RIPA裂解液、5×十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)蛋白上樣緩沖液及聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白檢測試劑盒(均購自碧云天生物技術(shù)公司)、尼龍膜(美國Pall公司)。

1.3方法

1.3.1檢測人正常結(jié)腸細胞HUM-CELL-0033及微衛(wèi)星不穩(wěn)定的人類結(jié)腸癌細胞LoVo細胞系中UCA1的水平 細胞的復(fù)蘇培養(yǎng)：從冰箱中取出儲存在凍存管中凍存的HUM-CELL-0033及LoVo細胞，將凍存管放置在37 ℃的水箱中進行水浴，使兩種細胞進行快速融化復(fù)蘇，經(jīng)過1 min HUM-CELL-0033及LoVo細胞已完全融化，1 min后取出凍存管，向其中加入α-MEM培養(yǎng)基，將其放置在特定條件的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃含有5%CO2，邊培養(yǎng)邊觀察細胞生長情況。PCR檢測：細胞經(jīng)Trizol法獲得總RNA，然后經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用引物(UCA1的上游引物為5′-GGAGCTGTTGAGCCTTCAGT-3′，下游引物為5′-ATTGAGAGCACAGTGGGGTG-3′)進行PCR擴增，ABI7300檢測同時分析各組細胞的UCA1水平。 PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。

1.3.2基因轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染開始的前1 d，把LoVo接種于6孔板上，這樣就會保證待轉(zhuǎn)染細胞在1 d之內(nèi)混濁度變?yōu)?0%～50%，然后依據(jù)LipofectamineTM 2000的說明書上的步驟開始實驗操作，在250 μl的Opti-MEN低血清培養(yǎng)基(無血清)中稀釋siRNA，慢慢搖晃至均勻，然后同樣將LipofectamineTM 2000在另外的250 μl Opti-MEN培養(yǎng)基中輕搖至勻，待雙方都靜置(室溫)5 min后混合在一起(注意：要在30 min內(nèi)混合LipofectamineTM 2000和siRNA的稀釋液)，搖勻，再次靜置20 min，接著下一步將混合物滴入到6孔板內(nèi)，輕搖，使混合物與孔內(nèi)的液體盡可能混勻。然后將其放入培養(yǎng)箱內(nèi)，室溫，5%CO2，待培養(yǎng)2～3 d后，接著進行轉(zhuǎn)染之后的實驗。siRNA的序列為：UCA1-siRNA正義鏈5′-GAGCCGAUCAGACAAACAATT-3′，反義鏈5′-UUGUUUGUCUGAUCGGCUCTT-3′；UCA1-siRNA2；陰性對照正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3′，反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。參照物GAPDH引物序列上游：5′-TCCTCTGACTTCAACAGCGACAC-3′；下游5′-TCTCTCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3′。實驗分組：對照組、空載質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染UCA1 siRNA組

1.3.3Transwell小室檢測下調(diào)表達UCA1對細胞侵襲能力的影響 將以上轉(zhuǎn)染完成2 d之后的每個小組，應(yīng)用Transwell侵襲實驗試劑盒分析UCA1對細胞侵襲力的變更，每個組分別設(shè)立3個復(fù)孔。采用胰酶分別消化每個組，然后PBS洗滌1～2次，接著調(diào)整細胞的密度(重懸)，在6孔板中按照每孔以1×105個把各組細胞置于Transwell上層的小室中，將無血清RPMI1640培養(yǎng)液(其內(nèi)含基質(zhì)凝膠)滴入小室內(nèi)，然后再將適量培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)滴入到底層小室其內(nèi)。培養(yǎng)箱的溫度為37℃，CO2濃度為5%，培育1 d。待培育結(jié)束時，棄掉孔內(nèi)的液體，同時PBS沖洗拿出來的小室，用棉棒小心的拂拭沒有遷移的細胞，然后以多聚甲醛固定0.5 h，并用0.04%結(jié)晶紫與之染色，倒置顯微鏡下記錄穿膜細胞的數(shù)目，每個實驗組任意抓拍8個視野，記錄其平均數(shù)值。此實驗重復(fù)3次。

1.3.4劃痕實驗觀察下調(diào)表達UCA1對細胞遷移能力的影響 將所用器械進行滅菌。先選取Marker筆在6孔板后標注平行線(間距約1 cm)，橫孔穿過且每孔至少穿過5條平行線。將Lovo細胞置于孔中，每孔約5×105個，過夜。等到細胞密度約為50%時，依據(jù)上面的分組進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染到4～5 h時，換液，然后繼續(xù)進行，直到2 d后細胞基本布滿時，將移液槍頭依著直尺，做到槍頭盡可能與6孔板反面的橫線垂直劃痕，千萬不可以劃歪。然后將細胞用PBS洗滌3次，棄除劃掉的細胞，更換培養(yǎng)基(不含有血清)。然后將其放進孵育箱(37℃，5%CO2)，培養(yǎng)。將劃痕處起始點標為時間0點，依照每6 h取樣，光學(xué)顯微鏡下拍照，然后測定劃痕距離。

1.3.5Western印跡檢測DNA錯配修復(fù)蛋白MSH2與MSH6的變化 將各組細胞待其被胰酶消化后收集放置，然后將RIPA試劑(含有蛋白酶抑制劑)用于裂解收集好的細胞，并將其擱置在冰塊上裂解0.5 h，同時每隔10 min震蕩搖晃細胞1次。然后放進離心機上，離心15 min(14 000 r/min，4℃)。用吸管將上清液吸出，通過使用BCA檢測法檢測此蛋白的濃度，使其水浴變性之后，將5倍SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液滴入其中，然后把蛋白裂解液(即含有相同量的蛋白)通過用PAGE分離，電改變至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，下一步使用PBS緩沖液(內(nèi)含5%脫脂牛乳)搖床密封60 min(37℃)，實驗所使用的一抗：MSH2抗體，MSH6抗體(都為稀釋的1∶1 000的抗人抗體，且都是單克隆抗體)，過夜培育(4℃)，完畢后用PBS-Tween洗膜15 min(37℃)，洗3次；而二抗使用抗兔〔辣根過氧化物酶(HRP)標記，1∶5 000)〕，同樣的培育(60 min，37℃)洗膜(3次，15 min)。最后用加強型化學(xué)發(fā)光液辨析其顯影。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0 軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1LoVo細胞系中UCA1的水平 在微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)腸癌細胞LoVo系中UCA1的表達量(1.29±0.11)，相比較正常結(jié)腸細胞HUM-CELL-0033明顯為高水平(0.84±0.10，P<0.05)，表明UCA1在結(jié)腸癌細胞呈現(xiàn)異常表達，即微衛(wèi)星不穩(wěn)定的人類結(jié)腸癌細胞LoVo中UCA1的程度顯著大于人普通結(jié)腸細胞HUM-CELL-0033中的相對表達的量。

2.2下調(diào)表達UCA1后細胞的侵襲能力 轉(zhuǎn)染UCA1siRNA組〔(20.63±2.79)個/高倍鏡視野〕比對照組細胞的穿膜數(shù)明顯減少〔(43.23±4.76)個/高倍鏡視野，P<0.05〕，空載質(zhì)粒組穿膜細胞數(shù)〔(41.98±4.43)個/高倍鏡視野〕與對照組無差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 下調(diào)表達UCA1后細胞侵襲能力的比較(×200)

2.3下調(diào)表達UCA1后細胞的遷移能力 劃痕愈合百分比：對照組為(73.68±7.32)%、空載質(zhì)粒組為(74.54±6.34)%、轉(zhuǎn)染UCA1siRNA組為(24.78±3.56)%。轉(zhuǎn)染UCA1siRNA后細胞劃痕兩側(cè)的間距較對照組明顯增大，劃痕的愈合速度有所減慢，表示細胞的遷移能力減弱，見圖2。

2.4MSH2與MSH6蛋白表達 轉(zhuǎn)染UCA1siRNA組中MSH2與MSH6的蛋白所顯現(xiàn)出的表達量明顯少于對照組，說明下調(diào)表達UCA1可明顯降低細胞中MSH2與MSH6的表達，見表1、圖3。

圖2 下調(diào)表達UCA1后細胞的遷移能力(×200)

表1 MSH2與MSH6蛋白表達

與對照組比較：1)P<0.05

圖3 MSH2與MSH6蛋白電泳表達

3 討 論

lncRNA是被定義為在真核基因轉(zhuǎn)錄后〔20～22〕，能夠產(chǎn)生多種缺少蛋白編碼能力的RNA，近年來lncRNA在多個系統(tǒng)的腫瘤都發(fā)現(xiàn)有異常表達〔23〕。雖然近些年來人們對lncRNA越來越關(guān)注，尤其是在腫瘤領(lǐng)域〔24〕的研究進展也有不少突破，但是具體的作用機制仍然需要深層剖析〔25〕。人們通過實驗及生物信息學(xué)分析證實UCA1屬于lncRNA，且發(fā)現(xiàn)并不在人正常組織中進行表達〔26〕。關(guān)于UCA1的表達也已經(jīng)被證實異常存在于腎癌、黑色素瘤〔27〕及口腔癌〔28〕和膀胱癌〔29〕等多種腫瘤組織中。lncRNA UCA1與一些消化系統(tǒng)腫瘤間的相關(guān)性經(jīng)過不斷的實驗研究，有關(guān)報道接踵而出。如于食管鱗狀細胞癌〔30〕而言，過表達的UCA1被證實能造成其預(yù)后不良。在胰腺癌的研究中也有學(xué)者〔31〕指出，若調(diào)高UCA1可使胰腺癌細胞系的PANC-1細胞的遷移和侵襲能力增強。還有肝癌〔32〕和胃癌〔33〕UCA1的作用機制正在逐步被人們鉆研。

當(dāng)今社會人們生活條件日益變好，而因?qū)︼嬍辰Y(jié)構(gòu)的不重視造成因結(jié)腸癌死亡人數(shù)的逐年增多〔34～36〕，對于結(jié)腸癌的治療也比較局限，隨著基因研究的不斷強大，探討基因與癌癥之間的關(guān)聯(lián)也是現(xiàn)代學(xué)者的重任。本研究顯示在結(jié)腸癌細胞中UCA1水平確實存在異常，且出現(xiàn)水平較高狀態(tài)，結(jié)腸癌細胞侵襲、遷移能力在下調(diào)UCA1后有所減弱。文獻〔37〕中提到，這兩種能力對于患者而言，在造成死亡人數(shù)數(shù)量巨大化方面，其影響程度毋庸置疑。由于有研究證實結(jié)腸癌的預(yù)后和臨床病理與DNA錯配修復(fù)相關(guān)聯(lián)〔38，39〕，即為當(dāng)DNA在復(fù)制時出現(xiàn)了基因的配對錯誤，然后通過一些蛋白進行修復(fù)〔40〕。本文提示UCA1下調(diào)后，DNA錯配修復(fù)蛋白MSH2與MSH6數(shù)量也明顯減少。

本文通過實驗檢測到在微衛(wèi)星不穩(wěn)定的結(jié)腸癌細胞中l(wèi)ncRNA UCA1出現(xiàn)高水平狀態(tài)，驗證了其對癌細胞侵襲和遷移能力的影響，這種影響還可能與DNA錯配修復(fù)蛋白MSH2、MSH6有關(guān)。