VEGF基因沉默脂肪間充質干細胞對人MKN45胃癌細胞生長的影響

安 琳 蘇慎勇 張 祎

(河北大學附屬醫院腫瘤內科，河北 保定 071000)

腫瘤細胞可以無限增殖至今仍是不能被人類所克服的疾病〔1～3〕。腫瘤無限增殖需要很多的條件，最為關鍵的一點即需要大量的血供，那么，腫瘤中的血管在腫瘤增殖轉移中起著極為重要的意義，這一點也成為我們攻克腫瘤的一個著手點，如果可以減少腫瘤中血管的數量，就可以很大程度上抑制腫瘤的生長。腫瘤細胞要自我增殖，其自身可以通過多種機制使得其周圍環境有益于其生長，其中當然包括最為重要的誘導的血管生成，這一過程是一個由多因素參與極為復雜的過程，而血管內皮生長因子(VEGF)則是眾多因素中較為重要的一個，在血管生成中發揮著非常重要的作用〔4～7〕。研究發現VEGF是目前發現的影響血管生成作用最強誘導因子，大量實驗已經證實其可以通過促進腫瘤血管的生成而促進腫瘤細胞的生長、增殖及轉移〔8～11〕。它可以通過促進血管內皮細胞(EC)生長，促進腫瘤血管的生成，從而為腫瘤生長創造了有利的條件，促進腫瘤細胞的增殖及轉移〔12〕。相關研究發現在一定條件下腫瘤細胞可以自己分泌大量VEGF，促進腫瘤血管形成，為自己生長，轉移創造條件，血液中VEGF大部分是由于腫瘤細胞自己分泌的，故我們可以通過測定腫瘤患者血液中VEGF含量，依此來判斷腫瘤生長的營養狀況及腫瘤的生長情況，為尋找更有效的治療方案提供一定的依據。 因此，有望通過抑制VEGF基因的表達，破壞腫瘤生長的有利環境，從而抑制腫瘤細胞的增殖、轉移〔13,14〕。脂肪間充質干細胞(ADSCs)是干細胞的一種，因此具有與干細胞相似的特性，相關研究將其用于各種疾病的治療，但是使ADSCs內VEGF基因沉默后觀察其對腫瘤的影響研究尚少，本實驗通過將ADSCs中的VEGF基因沉默后觀察其對人MKN45胃癌細胞系體內生長的影響。

1 材料與方法

1.1設計、時間及地點 隨機對照動物實驗于2014年1月至2015年12月在河北醫科大學動物實驗中心完成。

1.2實驗分組 根據GenBank中的VEGF基因序列及siRNA的設計原則，合成VEGF基因siRNA靶序列(5'-GATCCCCTCATCACGAAGTGGTGAAGttcaagagaCT-TCACCACTTCGTGATGATTTTTGGAAA-3')和一條陰性對照序列(即無關序列:5'-GATCCCCGTGAGATCGTAGTGCGTG-Attcaagaga-TCACGCACTACGATCTCACT-TTTTGGAAA-3')及其互補的反義鏈。采用Blaster軟件進行比對，并因此確定siRNA對靶基因的特異性。將分別與靶序列及陰性對照序列互補的兩條鏈經退火反應后形成雙鏈DNA，依此作為模板鏈。用相應限制性內切酶將pSUPER.retro.neo載體雙酶切形成線性化載體，將酶切反應產物進行電泳，然后將線性載體進行回收。然后用相應連接酶將線性載體進行連接，將模板鏈進行重組，形成重組載體，靶序列和陰性對照序列的重組載體分別命名為pSUPER-siRNA-VEGF載體和pSUPER-siRNA-N載體。也因此將其分為VEGF siRNA組，陰性對照組、空白對照組〔15〕。

1.3材料及來源 RNA干擾試劑盒(美國Ambion公司)、人VEGF定量酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、 Lipofectamine2000(Invitrogen生命技術公司)、RT-PCR所需引物及試劑 (Takara公司，日本)、Trizol試劑盒(杭州水然科技有限公司)、生物素標記的鼠抗人CD 34單克隆抗體(上海科順生物科技有限 公司)、顯微鏡(德國Leica公司)、紫外分光光度計購于上海奧析原、細胞培養箱購買自Heraeus Sepatech 公司、血糖儀從美國Johnson & Johnson公司提供、DMEM培養基(Gibco公司)、細胞培養瓶和培養皿購于上海百研生物科技有限公司，二氧化碳培養箱購于上海人和科技有限公司。

1.4方法

1.4.1基因siRNA沉默 根據GenBank中VEGF基因序列及siRNA的設計原則，從siRNA中選取僅于VEGF具有特異性的相關的序列，而與其他序列卻一點都不能匹配的序列，siRNA1：5'-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAATT-3',siRNA2:5'-GGCCAGCACATAGGAGAGA-3'，陰性對照序列：5'-GAUAGCAAUCACGAAGCGUATT-3'〔16〕。

1.4.2基因Lipofectamine2000介導轉染 根據轉染反應相關說明書的書寫要求進行操作，所有操作開始前，首先取少量處于生長對數期的MKN45胃癌細胞，將其置于6孔板中進行培養,培養時選用的培養基不含抗生素，經過24 h的培養，細胞生長融合已達到80%～90%，然后向其中加入含有siRNA的轉染試劑，加入后使其與細胞在一起孵育5 h，5 h后進行更換培養液，即倒出就得培養液同時加入新的繼續進行孵育。分別在培養的24 h，48 h，72 h和96 h后收集少量轉染細胞，接種裸鼠皮下，觀察胃癌細胞的生長情況及用于以下實驗,實驗重復2次〔17〕。

1.4.3RT-PCR檢測VEGF的表達 采用RT-PCR的方法檢測siRNA 轉染后各組細胞中 VEGF的表達情況，具體操作步驟如下：首先用Trizol試劑盒將各組細胞中總的 RNA提取出來，并從中提取少許進行逆轉錄反應，然后分別與轉染后的24 h、48 h、72 h檢測各組細胞VEGF的表達情況。β-actin 作內對照。PCR 反應體系為 50 μl。VEGF 基因 PCR 引物:擴增產物為 541 bp，正向 5'-GCCAACCTCAACTCAAGGAC-3'，反向 5'-AAGGAGCTGGATGAAGAGAC-3';β-actin 基因PCR 引 物:擴 增 產 物 為 291 bp，正 向 5'-ACCACAGCT-GAGAGGGAAATCG3'，反 向 5'-AGAGGTCCTTACGGATGTCAACG3'。針對抑制效果較好的序列，隨機設計兩對引物序列，作為siRNA的陰性對照siRNA/C1、siRNA/C2。擴增后取少許PCR產物進行電泳，并通過紫外照相進行掃描分析，用Alpha E-ase FCTM軟件分析，siRNA處理24 h、48 h、72 h，VEGF的表達水平變化，實驗重復3次〔18〕。

1.4.4通過CD34免疫組織化學法染色檢測胃癌組織血管生成情況 將各組裸鼠處死后，取含有MKN45胃癌細胞的組織進行消化，將消化后的細胞制成細胞懸液，取少許細胞懸液滴在事先準備好的含有載玻片的6孔板上，滴加細胞懸液后置入培養箱培養，培養時間延長，待細胞融合數達80%時，進行沖洗→固定→沖洗→封閉→加入抗體→沖洗→染色，經過以上步驟后置于顯微鏡下，調整顯微鏡至低倍鏡下全面觀察切片，找到血管分布最密的區域，切片不動，調整顯微鏡至高倍鏡下觀察并數出同一視野下的血管數目，同樣的方法分別選取5個視野進行計數，獲得5個視野內血管數的平均值，依此值作為平均血管密度(MVD)值〔19〕。

1.5統計學方法 應用SPSS17.0 軟件進行χ2及t檢驗。

2 結 果

2.1RT-PCR檢測VEGF的表達 與陰性對照組(0.69±0.04)和空白對照組(0.66±0.03)比較，VEGF siRNA組VEGF表達顯著降低(0.33±0.02，P<0.05)，見圖1。

2.2基因轉染后胃癌細胞生長情況 陰性對照組和空白對照組的ADSCs在裸鼠體內可顯著促進MKN45胃癌細胞的生長，兩組的腫瘤重量分別為(1.84±0.12)g，(1.83±0.15)g，明顯高于VEGF siRNA組的腫瘤重量〔(1.11±0.14)g，P<0.05〕，而VEGF siRNA組ADSCs在裸鼠體內對MKN45胃癌細胞的生長無促進作用，與單純MKN45組腫瘤重量〔(1.12±0.15)g〕差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3各組MVD比較 陰性對照組和空白對照組MVD分別為(10.9±0.64)個/視野，(10.7±0.50)個/視野，均明顯高于VEGFsiRNA組，〔(5.3±0.36)個/視野，P<0.05〕，單純MKN45組為(5.1±0.52)個/視野，與VEGF siRNA組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖1 RT-PCR檢測各組VEGF mRNA表達

圖2 各組CD34免疫組化表達(DAB，×200)

3 討 論

腫瘤雖有無限增殖及遠處轉移的特性，但是如果沒有支持其無限增殖及遠處轉移的條件，其同樣不可能實現以上過程。其中對其增殖及轉移最為重要的條件即為營養支持。而腫瘤中形成血管是為其自身提供營養支持的最重要的過程。研究發現這個過程是一個由許多生長因子調控的非常復雜的過程，而VEGF是這一過程中最為重要的誘導因子，是具有相似作用的一類因子中作用最強的〔20～22〕。

干細胞可以在特定條件下分化成為多種不同的組織器官而被廣泛應用于各種疾病的治療中〔23，24〕。與骨髓干細胞類似，ADSCs由脂肪組織提取而來，因此來源較其他干細胞更廣泛。以往人們認為脂肪是人體肥胖之源，瘦身后抽出的脂肪組織都當成廢棄物丟棄，現經由醫學專家研究證實，同骨髓中存在造血干細胞一樣，脂肪組織中同樣含有大量的間質干細胞，這種間質干細胞也具有體外增生及多重分化的潛力。

VEGF是一種二聚體蛋白，其分子量為34～ 50 kD，其主要作用機制有①通過增加微血管的通透性，使得血管中的分子透過血管壁到達血管外，也是腫瘤細胞可以透過血管壁進入血液，即造成腫瘤的血液轉移；②通過作用于EC上相應受體而促進EC的增殖。通過以上作用機制為腫瘤細胞的生長及轉移提供了有利的條件〔25～28〕。大量研究證實在各種腫瘤患者血液中VEGF含量均明顯升高〔29～33〕。腫瘤的轉移需要經過一系列復雜的過程，在其中生長出血管是其轉移過程必須包括的一步。相關研究表明MVD與腫瘤生物學特性有密切的關系〔34～37〕，因腫瘤血管可以為腫瘤提供重要的營養支持，在尚未形成血管的時候，腫瘤是很少甚至不發生轉移的，隨著發病時間的延長，慢慢地在其中生成血管且數量逐漸增多，這使得腫瘤細胞獲得充足營養進行增殖，并且進入血管的機會也大為增加，這與其周圍環境有利于其進入血管有關。眾多研究發現，隨著MVD的增加腫瘤侵襲轉移等惡性潛能也明顯增加〔38～40〕。

本研究結果顯示ADSCs 內VEGF基因沉默后VEGF明顯降低，與MKN45胃癌細胞混合后接種對胃癌組織血管形成和胃癌生長無影響。