電針對(duì)腦卒中后抑郁大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞γ-氨基丁酸、血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響

趙立峰 傅潤熹 嚴(yán)嘉寧 余 濤 陸方琴 韋登明

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室，浙江 寧波 315211)

針刺治療腦卒中后抑郁(PSD)在臨床上有確切的療效〔1〕，但其治療機(jī)制尚不完全清楚。普通抑郁癥的發(fā)病與谷氨酸與γ-氨基丁酸(GABA)及其受體變化有關(guān)； GABA及其受體表達(dá)增多具有神經(jīng)毒作用，通常認(rèn)為缺血使興奮性氨基酸增加，胞內(nèi)Ca2+聚集，繼而引發(fā)一系列反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。腦缺血過程中伴有的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)水平變化與缺血性腦血管病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。VEGF除了通過調(diào)控新生血管的形成對(duì)缺血性腦損傷后的神經(jīng)細(xì)胞具有直接的營養(yǎng)和保護(hù)作用外，還具有其他多種直接和間接的神經(jīng)保護(hù)作用〔2〕。針刺是一種安全無毒療效顯著的治療手段，經(jīng)過前期研究工作的積累，已經(jīng)確定其對(duì)PSD有治療效果〔3〕。但PSD的發(fā)病及電針治療機(jī)制是否與腦神經(jīng)細(xì)胞GABA及VEGF的表達(dá)含量變化有關(guān)尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在通過檢測電針對(duì)PSD大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞GABA及VEGF表達(dá)含量的影響，研究電針對(duì)PSD的治療效果和相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 Wistar大鼠40只，購于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)0102016。均為雄性，體重280～320 g，自由飲食。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，分為正常組，假手術(shù)組，模型組和電針組，每組10只。

1.2試劑儀器 G6805 電針儀(上海華誼儀器制造廠生產(chǎn))，曠場及記錄儀(上海移數(shù)動(dòng)物學(xué)系統(tǒng))，兔抗大鼠GABA多克隆抗體、兔抗大鼠VEGF多克隆抗體、生物素化羊抗兔 IgG、鏈霉親合素-生物素(SABC)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)，BM-Ⅶ包埋機(jī)(宏業(yè)醫(yī)用儀器公司)；HM-325石蠟切片機(jī)(德國LEICA公司)；CX40生物顯微鏡(日本olympus公司)。

1.3模型制備 以10%水合氯醛0.3 ml/100 g，腹腔麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部正中切開皮膚，暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)和迷走神經(jīng)。將CCA用動(dòng)脈夾夾閉10 min，再通20 min，再夾閉10 min。以青霉素局部消毒再縫合，放回鼠籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組麻醉及手術(shù)過程同上，但不夾閉CCA。飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行行為學(xué)檢測。對(duì)腦卒中模型成功大鼠予以孤養(yǎng)、慢性不可預(yù)見的溫和性應(yīng)激(CUMS)制備PSD模型〔4〕：①禁食禁水20 h；②禁水17 h；③傾斜鼠籠(45°)17 h；④持續(xù)光照17 h；⑤濕籠(100 g鋸屑+200 ml水)21 h；⑥4℃強(qiáng)迫游泳5 min；⑦水平搖晃5 min；⑧行為限制(束縛)2 h；⑨夾尾1 min。9種刺激每日隨機(jī)采取1種，共21 d，單籠飼養(yǎng)，再次進(jìn)行行為學(xué)檢測。

1.4電針治療方法 PSD模型成功后，電針“百會(huì)”、“大椎”，“百會(huì)”位于頂骨正中，“大椎”在第7頸椎與第1胸椎間，背部正中。施以連續(xù)波，頻率50 Hz，強(qiáng)度以大鼠安靜耐受為度(約2.0 rflA)，每天電針1次，留針20 min，連續(xù)治療15 d。

1.5檢測方法

1.5.1行為學(xué)檢測 采用曠場試驗(yàn)(open-field)法〔5〕，用小動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)測定5 min內(nèi)大鼠穿線次數(shù)和抬壁次數(shù)，其中第1分鐘不計(jì)時(shí)，大鼠適應(yīng)環(huán)境，保持環(huán)境安靜與黑暗。

1.5.2腦組織GABA和VEGF免疫組織化學(xué)染色觀察 以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3 ml/100 g體重)，暴露心臟，先以生理鹽水100 ml經(jīng)主動(dòng)脈沖洗，繼續(xù)灌注由4%多聚甲醛與1%戊二醛組成的磷酸緩沖液(pH7.4)200 ml，再持續(xù)滴注40 min，斷頭取腦。石蠟包埋切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。切片經(jīng)常規(guī)脫蠟、脫水、3%H2O2滅活內(nèi)源性酶、微波抗原修復(fù)，正常山羊血清封閉，分別滴加VEGF和GABA一抗，濕盒中4℃冰箱過夜。滴加相應(yīng)二抗，SABC反應(yīng)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。分色、脫水、透明、封片、光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組化染色結(jié)果。陰性對(duì)照：用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗；陽性區(qū)域?yàn)樽攸S色，400倍光鏡下，每張切片隨機(jī)選取4個(gè)視野檢測，計(jì)算平均積分光密度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測 采用SPSS13.10軟件行單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1電針治療對(duì)大鼠行為學(xué)表現(xiàn)的影響 正常組與假手術(shù)組穿線次數(shù)〔(17.10±4.90)次 vs (13.6±3.43)次〕、抬壁次數(shù)〔(14.1±3.41)次vs(12.3±3.71)次〕的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但模型組的穿線次數(shù)〔(8.29±2.75)次〕、抬壁次數(shù)〔(5.71±1.80)次〕較正常組和假手術(shù)組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電針治療后，電針組的穿線次數(shù)〔(9.36±4.39)次〕、抬壁次數(shù)〔(7.10±5.15)次〕較模型組明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示電針對(duì)PSD大鼠的抑郁有改善作用。

2.2電針對(duì)腦組織GABA、VEGF表達(dá)的影響 模型組GABA明顯升高，腦神經(jīng)細(xì)胞染色呈強(qiáng)陽性；與模型組比較，電針組GABA表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組VEGF的表達(dá)較假手術(shù)組升高，電針組VEGF的表達(dá)與模型組比較明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1，圖2，表1。

圖1 GABA免疫組織化學(xué)染色圖(×400)

圖2 VEGF免疫組織化學(xué)染色圖(×400)

表1 電針對(duì)大鼠腦組織GABA及VEGF表達(dá)的影響

3 討 論

急性腦卒中患者預(yù)后最常見的精神心理障礙就是抑郁。據(jù)相關(guān)報(bào)道，急性腦卒中患者并發(fā)抑郁最高可達(dá)60%〔6〕。針刺作為中醫(yī)治療的一種手段，具有安全、無毒、療效顯著等優(yōu)點(diǎn)。PSD患者更易出現(xiàn)認(rèn)知功能損害，電針抗抑郁治療后抑郁癥狀緩解，認(rèn)知功能亦可好轉(zhuǎn)〔7〕。針刺治療 PSD 的效果與口服鹽酸氟西汀膠囊相當(dāng)，且具有起效快、副反應(yīng)小、明顯提高患者生存質(zhì)量的優(yōu)越性。然而，針刺治療PSD的機(jī)制尚不十分清楚，限制了針灸療效的進(jìn)一步提高。百會(huì)位居巔頂，與大椎均為諸陽之會(huì)，刺之可調(diào)動(dòng)一身之陽氣；喬瑞瑞等〔8〕研究表明電針此兩穴對(duì)慢性抑郁確有療效。本研究提示，電針對(duì)PSD大鼠的行為表現(xiàn)有改善作用，提示電針百會(huì)與大椎穴位有改善PSD的效果。

堿性成纖維生長因子(bFGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、VEGF及表皮生長因子(EGF)等均可促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化〔9〕。抑郁癥患者海馬體積縮小，神經(jīng)元的修復(fù)可以使其恢復(fù)正常。大腦海馬部有較多的生長因子(如bFGF、EGF、VEGF)〔10〕，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示電針百會(huì)與大椎穴位可促進(jìn)腦神經(jīng)細(xì)胞高表達(dá)VEGF，再次印證了海馬VEGF對(duì)神經(jīng)元的修復(fù)與再生是有重要意義的。筆者推測，電針通過促進(jìn)腦神經(jīng)細(xì)胞VEGF高表達(dá)，提高神經(jīng)元修復(fù)能力，達(dá)到抗PSD的治療效果。

腦卒中時(shí)，GABA(抑制性遞質(zhì))與谷氨酸(興奮性遞質(zhì))對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞有較大的毒性，PSD的發(fā)生機(jī)制與GABA表達(dá)失衡有明顯關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果提示GABA高表達(dá)參與PSD的發(fā)病過程，電針可抑制PSD大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞GABA的表達(dá)。

綜上所述，電針對(duì)PSD有一定的治療效果，其機(jī)制可能與下調(diào)腦神經(jīng)細(xì)胞GABA水平和促進(jìn)對(duì)神經(jīng)損傷有修復(fù)效果的VEGF高表達(dá)有關(guān)。