養血解毒湯對銀屑病模型小鼠JAKs-STAT信號通路及炎性因子的影響

肖衛棉 查旭山

(肇慶市皮膚病醫院皮膚科，廣東 肇慶 526020)

銀屑病是慢性炎癥增生性疾病，是皮膚科多發病、常見病，容易反復發作，是皮膚科難治病之一，屬于自身免疫性疾病，以紅斑鱗屑為主要臨床表現，主要特點為角質形成細胞異常分化和過度增殖〔1,2〕。養血解毒湯在銀屑病的治療上效果顯著〔3〕，但其機制尚不十分清楚。本文選擇昆明小鼠雌激素期增生的陰道上皮模型和尾鱗片表皮模型，觀察養血解毒湯對銀屑病的干預作用及對Janus激酶(JAKs)-信號轉導子與轉錄激活子(STAT)信號通路及炎性因子的影響。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物：雌性、體重20～24 g、昆明種小鼠24只，購自北京斯貝福實驗動物科技有限公司，許可證號：SCXK(京)2015-0004。

藥物：養血解毒湯所含藥物土茯苓、當歸、雞血藤、玄參、草河車、麥冬、生地、車前子、板藍根、丹參等由該院中藥房提供，制劑室按成人劑量換算成小鼠用量，制成水煎劑，質量控制由制劑室負責。甲氨蝶呤片(廠家：江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，國藥準字H32024655，批準日期：2015-09-02，規格2.5 mg)，戊酸雌二醇片(廠家：北京協和藥廠，國藥準字H20000031，批準日期：2010-12-17，規格：0.5 mg)。

主要試劑：二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(美國Abcam公司)，兔抗人STAT3單克隆抗體、兔抗人磷酸化(P)-STAT3單克隆抗體、兔抗人STAT5單克隆抗體、兔抗人P-STAT5單克隆抗體，TRIzol總RNA提取試劑(美國Sigma公司)等。

1.2方法

1.2.1模型建立 雌激素周期小鼠陰道上皮模型：實驗開始前3 d給予昆明小鼠戊酸雌二醇(每天1次，每次10 mg/ml)灌胃，使陰道上皮處于雌激素期從而模擬昆明小鼠表皮增生過快特點。尾部鱗片表皮模型：昆明小鼠尾部鱗片表皮正常角化，沒有顆粒層形成，可直接模擬銀屑病角化不全、分化障礙的特點。

1.2.2小鼠分組及處理 將24只昆明小鼠根據隨機數字法分為生理鹽水組、養血解毒湯組、甲氨蝶呤組，每組8只。養血解毒湯組小鼠每天給予養血解毒湯水煎劑(0.2 ml)灌胃，甲氨蝶呤組小鼠每天給予甲氨蝶呤片水溶液(0.2 ml)灌胃，生理鹽水組每天給予等量生理鹽水灌胃，共6 d。

1.2.3各組小鼠陰道上皮有絲分裂指數測定 治療結束次日清晨9點脫臼處死小鼠，取陰道組織用甲醛固定、石蠟包埋、常規HE染色，顯微鏡下觀察小鼠陰道上皮有絲分裂的基底細胞，計算陰道上皮有絲分裂指數，陰道上皮有絲分裂指數為每100個基底細胞中有絲分裂細胞個數。

1.2.4各組小鼠尾部顆粒層片數測定 取小鼠尾部皮膚用甲醛固定、石蠟包埋、常規HE染色，顯微鏡下觀察小鼠的尾部鱗片數，有顆粒層形成的鱗片為鱗片表皮有連續成行的顆粒細胞，尾部顆粒層片數為每100個鱗片中有顆粒層的鱗片數。

1.2.5小鼠陰道上皮和尾部組織中STAT3、P-STAT3、STAT5、P-STAT5表達測定 將小鼠陰道上皮和尾部組織切片脫蠟至水，采用免疫組化法測定組織中STAT3、P-STAT3、STAT5、P-STAT5表達，將各組小鼠的免疫組化圖像經Image-Pro Plus軟件分析得出陰道上皮和尾部組織中STAT3、P-STAT3、STAT5、P-STAT5的光密度值。

1.2.6小鼠陰道上皮和尾部組織中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、干擾素(INF)-γ mRNA測定 將各組小鼠陰道上皮組織和尾部組織研磨后，提取總RNA，測定RNA的含量和純度，選取RNA完整、無污染的總RNA進行逆轉錄為cDNA，采用RT-PCR測定陰道上皮和尾部組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA表達，PCR擴增條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s、55℃ 5 s共39個循環；65℃ 5 s、95℃ 10 s。以2-ΔΔCt作為TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ基因的相對表達量。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0軟件，計量資料采用方差分析，組內兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結 果

2.1各組陰道上皮有絲分裂指數比較 三組小鼠陰道上皮有絲分裂指數比較差異有統計學意義(F=42.001，P=0.000)，其中養血解毒湯組(13.29±2.21)和甲氨蝶呤組(12.58±1.87)小鼠陰道上皮有絲分裂指數均低于生理鹽水組(30.03±4.59，P<0.05)，養血解毒湯組和甲氨蝶呤組小鼠陰道上皮有絲分裂指數比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2各組小鼠尾部顆粒層片數比較 三組小鼠尾部顆粒層片數比較差異有統計學意義(F=7.082，P=0.000)，其中養血解毒湯組(12.28±1.11)和甲氨蝶呤組(13.19±1.23)小鼠尾部顆粒層片數高于生理鹽水組(7.76±1.02，P<0.05)，養血解毒湯組和甲氨蝶呤組小鼠尾部顆粒層片數比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3各組小鼠陰道上皮及尾部皮膚中STAT3、P-STAT3、STAT5、P-STAT5表達比較 三組小鼠陰道上皮及尾部皮膚中STAT3和STAT5光密度值差異無統計學意義(P>0.05)，P-STAT3和P-STAT5光密度值差異有統計學意義(P<0.05)，其中養血解毒湯組和甲氨蝶呤組P-STAT3、P-STAT5光密度值低于生理鹽水組(P<0.05)，養血解毒湯組和甲氨蝶呤組P-STAT3、P-STAT5光密度值差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠陰道上皮及尾部皮膚中STAT3、P-STAT3、STAT5、P-STAT5顆粒光密度值比較

與生理鹽水組比較:1)P<0.05；下表同

2.4各組小鼠陰道上皮及尾部皮膚中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA比較 三組小鼠陰道上皮及尾部皮膚中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA差異有統計學意義(P<0.05)，其中養血解毒湯組和甲氨蝶呤組TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA低于生理鹽水組(P<0.05)，養血解毒湯組和甲氨蝶呤組陰道上皮中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠陰道上皮及尾部皮膚中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA水平比較

3 討 論

銀屑病與多基因遺傳關系密切，病灶內異常T淋巴細胞浸潤為銀屑病發生的中心環節，異常活化的T細胞可分泌多種細胞因子，細胞因子通過JAKs/STATs等多條信號通路，參與角質形成細胞的異常分化、過度角化、血管異常增生等多種病理過程，因此JAKs/STATs信號通路在銀屑病的免疫反應和炎癥反應及細胞信號傳遞中發揮重要作用〔4，5〕。

STAT是JAKs的作用底物，是一種獨特的蛋白家族，能夠與DNA結合。STAT包含7個家族成員：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6，STATs在未激活細胞中存在于細胞質中,當促紅細胞生成素、集落刺激因子、干擾素等因子和受體結合后，引起受體二聚化，相應受體的二聚化使JAKs發生磷酸化而被活化，磷酸化的JAKs使相連受體的酪氨酸殘基磷酸化，酪氨酸殘基的磷酸化使酪氨酸位點暴露，并與氨基酸序列結合，把含有SH2結構域的STATs吸引到酪氨酸位點處，JAKs引起與受體相連的STATs磷酸化，磷酸化的STATs從受體脫落，形成二聚體，活化的STATs二聚體進入細胞核，和目標啟動子區域結合，影響基因的轉錄、表達〔6，7〕。

銀屑病為一種T細胞異常表達的免疫性疾病，在銀屑病的發病過程中，T細胞局部活化發揮重要作用〔8，9〕，活化的T細胞可分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ等一系列細胞因子，分泌的上述細胞因子刺激鄰近的內皮細胞、單核巨噬細胞、角質形成細胞等通過旁分泌或者自分泌的方式分泌大量細胞因子，使多種細胞因子發生級聯放大反應；各細胞因子之間相互調節，形成復雜的細胞因子網絡〔10，11〕。

養血解毒湯的君藥為雞血藤和土茯苓，雞血藤具有養血作用，土茯苓具有解毒作用，佐以當歸、丹參、草河車、板藍根、玄參，當歸和丹參具有養血潤膚作用，草河車、板藍根、玄參具有祛濕解毒作用，體現了養血解毒湯的養血活血、祛濕解毒的治療原則〔12〕，在銀屑病的治療中效果顯著〔13〕。本文結果發現，養血解毒湯可降低小鼠陰道上皮有絲分裂指數，升高尾部顆粒層片數，降低小鼠陰道上皮和尾部皮膚中P-STAT3、P-STAT5表達及陰道上皮和尾部皮膚中TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ mRNA表達，其作用效果與甲氨蝶呤類似。可見，養血解毒湯對銀屑病具有治療作用，其機制可能與養血解毒湯可抑制上皮細胞有絲分裂、促進表皮顆粒層生成、抑制STAT3和STAT5磷酸化，減少炎性因子水平有關。銀屑病患者體內存在免疫平衡失調，TNF-α、IL-1β、IL-6、INF-γ等炎性細胞因子分泌異常，炎性因子的異常分泌作為細胞外刺激信號激活角質形成細胞上的JAKs激酶，引起JAKs發生自身磷酸化，募集細胞內的STATs形成二聚體，STATs二聚體進入細胞核與相關基因結合，對T細胞分化、毛細血管增生、角質形成細胞異常增殖等過程發揮調控作用，從而引起銀屑病的發生發展〔14，15〕。