肺抑瘤膏對EGFR野生型Lewis肺癌小鼠腫瘤生長及VEGF表達的影響

彭召云 鄭 心 孟憲志 李新昌 魯興隆 李龍祥

(山東中醫藥大學第二附屬醫院，山東 濟南 250001)

原發性支氣管肺癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，其中，肺腺癌約占肺癌發病率的25%〔1〕，確診時絕大多數已屬中晚期，且化療耐藥、放療抵抗、分子靶向治療耐藥等問題的存在〔2,3〕，應用單一治療方法難以獲得滿意療效，表皮生長因子受體(EGFR)非基因突變型肺腺癌靶向治療效果差〔4〕，因此，積極尋找有效的抗EGFR非基因突變型肺腺癌的新方法成為當前研究的熱點、難點。本實驗通過觀察肺抑瘤膏干預EGFR非基因突變型小鼠肺腺癌移植瘤模型，探討抑制EGFR非基因突變型肺腺癌發生發展的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 C57BL/6近交系雄性小鼠(動物合格證號SCXK(京)2009-0004)，6～8周齡，體重(18±2)g。接種了Lewis鼠源肺腺癌細胞株的小鼠購于山東省醫學科學院。于SPF級動物房自由飲水攝食飼養，溫度20～24℃，相對濕度50%～60%。通風良好條件下，常規飼養至適應環境后，進行造模。

1.2主要實驗試劑及藥物 Taq DNA聚合酶、DNA分子量Marker(寶生物公司產品)，測序試劑：ABI BigDye3.1。二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE電泳液、預染Marker、內參、內參二抗、血管內皮生長因子(VEGF)抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、聚偏氟乙烯(PVDF)膜等(碧云天)。0.9%氯化鈉注射液(中國大冢制藥有限公司)，肺抑瘤膏(每毫升膏方含生藥量約4.3 g)由山東中醫藥大學第二附屬醫院藥劑科提供。

1.3造模方法 頸椎脫臼法處死腫瘤生長良好的Lewis肺腺癌荷瘤小鼠，在超凈工作臺上用無菌剪刀、鑷子完整剝離腫瘤組織，于冰上研磨并制備細胞懸濁液，離心計數后調整細胞濃度為1.0×107/ml，在小鼠腋窩下接種腫瘤細胞懸液0.2 ml/只(約含瘤細胞2.0×106個)。

1.4分組及給藥 接種腫瘤細胞后，每日觀察小鼠腋下移植瘤生長情況，當能用游標卡尺測到瘤體時，按照SPSS統計軟件隨機設立生理鹽水對照組、肺抑瘤膏干預組，每組10只。分組后開始灌胃。對照組每天予生理鹽水灌胃0.2 ml/次。干預組每天予肺抑瘤膏灌胃0.2 ml/次(相當于70 kg成人按體表面積折算的等效劑量)。

1.5EGFR基因測序 引物序列：fw-18：TCAGGTCTGCTCCCTTCTTC，rs-18：CAGCTACATTCCCAGTCTAC GT。fw-19：TTGGATTTGTAATGTAGAGCCC，rs-19：AACTAAGGAAGCAAGATTGACC。fw-20：AGTCTTGCA TAACCTGACACTTG，rs-20：TCATCCTTGCTGCTTTTC TT。fw-21：AGGATGCCCAGATGGTTCA，rs-21：GCTGGTCTTTTGAGGGGTG。PCR 擴增:① PCR 反應體系(50 μl)：10×PCR緩沖液5 μl，dNTP(10 μmol/L)1 μl，primer-fw(10 μmol/L)2 μl，primer-rs(10 μmol/L)2 μl，Template 2 μl，二甲基亞砜(DMSO)1.5 μl，ddH2O 37.5 μl。②PCR 反應條件:95℃ 5 min 1個循環，95℃ 30 s 35個循環，50℃ 30 s 35個循環，72℃ 30 s 35個循環，72℃ 10 min 1個循環。

1.6觀察指標及方法 (1)瘤體體積：剝離瘤體后用精度為0.01 mm游標卡尺測量瘤體最長徑、最短徑，計算瘤體體積。瘤體體積(mm3)=π×最長徑×最短徑2/6。(2)瘤重、抑瘤率及移植瘤生長指數：末次灌胃24 h后稱重處死存活小鼠，剝離瘤體，稱瘤重，計算各組腫瘤抑制率。腫瘤抑制率=(對照組平均瘤重-干預組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。移植瘤生長指數=移植瘤重量/去除腫瘤后的小鼠體重。(3)VEGF檢測：免疫印跡法檢測移植瘤中VEGF蛋白表達以及β-actin灰度比值比較。(4)EGFR檢測：小鼠移植瘤EGFR基因(18、19、20、21 號外顯子)毛細管電泳測序。

1.7統計學方法 采用 SPSS17.0統計軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1一般情況 隨移植瘤的生長，兩組小鼠活動均減少，攻擊性降低，精神萎靡，進食、飲水減少，毛發無光澤易脫落，對照組表現較干預組明顯。

2.2種植成功率 接種Lewis細胞后1 w內所有小鼠腋下可觸及移植瘤，瘤體體積均可達100～150 mm3，成瘤率100%。

2.3瘤體體積 小鼠移植瘤種植第10天后，腫瘤體積迅速增長，可見明顯“拐點”。兩組小鼠可明顯看出肺抑瘤膏干預后，小鼠移植瘤體積增長明顯減緩，最后一次瘤體體積差異有統計學意義(P=0.028)，見圖1。

圖1 瘤體體積增長曲線

2.4兩組瘤重、抑瘤率、移植瘤生長指數比較 干預組瘤重、生長指數明顯低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組移植瘤瘤重、抑瘤率、生長指數比較

與對照組比較：1)P=0.00，2)P=0.013

2.5VEGF檢測結果 干預組移植瘤VEGF表達(0.055 5±0.012 1)低于對照組(0.110 1±0.015 6)，差異有統計學意義(P=0.00)，見圖2。

圖2 VEGF蛋白的Western印跡結果

2.6EGFR基因毛細管電泳測序結果 18、19、20、21 號外顯子均測序合格。其中20 號外顯子含polyA和polyG結果，已經進行加測反應；比對結果顯示無明顯突變，見圖3、4。

圖3 樣品基因組DNA電泳圖

圖4 PCR擴增產物電泳圖

3 討 論

肺癌居全球癌癥首位〔5〕，且發病率和死亡率還在不斷增長〔6〕。現代醫學對于肺癌缺乏有效的治療方法，放化療有諸多的不良反應及局限性，EGFR非基因突變型肺腺癌靶向治療效果不佳。目前臨床迫切需要安全、有效的綜合治療方案。近年來臨床研究表明中醫藥在提高肺癌患者生活質量、顯著緩解病痛、延長生存期限、穩定腫瘤病灶等方面有著不可替換的優勢〔7～9〕。在腫瘤防治方面的應用日趨被接受并得到重視，中藥抗EGFR非基因突變型肺腺癌的研究有重要臨床意義。

中醫膏方中以黨參、黃芪為君補益肺脾之氣；白術祛濕助脾氣健運、茯苓滲濕健脾、麥冬養陰生津潤肺清心、女貞子滋補肝腎共為臣藥。佐以浙貝、夏枯草、山慈菇清熱散結，薏苡仁滲濕健脾，貫眾清熱涼血，莪術破血行氣、消積止痛，蜂房攻毒破積。生甘草清熱解毒，調和諸藥為使。本方諸藥合用，組方嚴謹，扶正而不斂邪，祛邪而不傷正，氣血同治，寒熱平調，平補陰陽，無耗氣傷陰之弊。整體體現了扶正祛邪、動靜結合、攻補兼施的配伍特點。前期臨床研究發現晚期肺癌患者應用肺抑瘤膏，可有效控制原發腫瘤病灶，減輕化療引起的毒副反應，提高患者的生存質量，延長患者生存期〔8～11〕。且膏劑有口感好、劑型小、服用量少、便于攜帶、易于耐受等優點，充分體現了中藥簡、便、廉、驗的特點。前期動物實驗從抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、提高機體免疫功能等多環節入手進行了一系列研究〔8～13〕，但對EGFR非基因突變型肺腺癌的實驗研究尚屬首次。

本實驗通過EGFR基因測序，證實Lewis肺腺癌EGFR基因為非基因突變型。本實驗結果提示肺抑瘤膏對EGFR非基因突變型肺腺癌移植瘤原發病灶有明顯的抑制作用，能有效抑制其瘤體生長，降低移植瘤的生長率，且能降低VEGF表達。研究表明〔7〕VEGF有強烈加速血管上皮細胞的分化作用，從而誘導新血管生成，腫瘤的生長、轉移及轉移部位的生長與血管新生密切相關。降低VEGF的表達可減少腫瘤新生血管的增生，最終抑制腫瘤的進展。故推斷肺抑瘤膏治療EGFR非基因突變型肺腺癌是通過抑制VEGF的表達從而起到抑制腫瘤的目的。為尋找新的抗EGFR非基因突變型肺腺癌藥物提供了思路。