外周血Th22/Treg細胞在多發性硬化患者中的水平及與嚴重程度的關系

甄 瑾 馬翔凌 田曉艷 丁海濤 傅永旺 李 攀

(內蒙古自治區人民醫院神經內科，內蒙古 呼和浩特 010017)

多發性硬化(MS)是以中樞神經系統白質脫髓鞘為特征的自身免疫性疾病，神經中樞斑片狀的炎性浸潤及脫髓鞘是MS的主要病理表現〔1〕。MS病灶播散廣泛且臨床癥狀較為復雜多變，發病機制尚未完全闡明，目前普遍認為T淋巴細胞介導的免疫應答在MS的發病過程中有重要作用。傳統觀點認為，Th1細胞及巨噬細胞是引起白質脫髓鞘的主要原因〔2〕，然而近年來不斷有研究表明，Th22細胞、調節性T細胞(Treg)及自然殺傷(NK)細胞等具有免疫調控功能的細胞及其相關細胞因子均在MS的發生過程中起重要作用〔3,4〕。本研究著重對MS患者的Th22、Treg細胞進行分析，并對相關細胞因子白細胞介素(IL)-22、IL-35進行檢測，旨在研究Th22/Treg細胞在MS發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1月至2016年2月在內蒙古自治區人民醫院就診的復發緩解型MS(RR-MS)急性期患者39例為MS組，男14例，女25例，年齡25～61歲，平均(48.34±5.28)歲，病程0.8～12.0年，平均(5.56±3.20)年；健康體檢者35例作為對照組，男14例，女21例，年齡27～60歲，平均(47.16±4.87)歲。兩組研究對象的年齡、性別差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

MS組納入標準：①符合2010年MacDonald標準中的RR-MS型診斷標準〔5〕；②入院前3個月內未使用免疫調節劑或糖皮質激素；③出現不同程度神經系統陽性癥狀。排除標準：①合并患有其他免疫性疾病者；②有腦梗死或腦出血等腦部或中樞神經系統疾病；③發生嚴重感染，有重度炎癥；④高血壓、糖尿病及肝功能異常患者。對照組均無免疫類疾病史。

本研究課題已獲倫理委員會批準，所有入組對象簽署知情同意書。

1.2外周血中Th22和Treg細胞檢測 (1)樣品采集：空腹抽取所有研究對象的外周靜脈血，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，采用Ficoll分層密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，并調整細胞濃度為1×106個/ml。(2)Th22細胞檢測：在調整后的細胞懸液中加入佛波酯(PMA)、莫能霉素及離子霉素于37℃、5%CO2培養箱中培養4 h；用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，加入PETC-CD4抗體，4℃避光放置，孵育30 min；固定破膜后加入PE-IL-22抗體，4℃繼續避光孵育30 min，采用FACSCanto Ⅱ流式細胞儀進行檢測，結果采用FACS Diva7.0軟件進行處理，以Th22細胞所占CD4+T細胞的比例表示Th22細胞水平。(3)Treg細胞檢測：取已調整濃度的外周血，加入PETC-CD4抗體和APC-CD25抗體，4℃避光孵育30 min；固定破膜后加入轉錄因子叉頭蛋白(Foxp)3封閉劑封閉5 min；加入PE-Foxp3抗體，4℃繼續避光孵育2 h，檢測方法同Th22細胞。

1.3血漿中IL-22和IL-35的測定 空腹采集靜脈血5 ml，采用肝素抗凝，3 000 r/min離心15 min，收集血清于無菌0.5 ml EP管中，-20℃保存待檢。采用雙抗夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定血清IL-22和IL-35表達水平。所有操作嚴格按照試劑盒說明進行，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.4MS患者病情評估 根據Kurtzke的EDSS評估量表〔6〕，從運動、感覺、認知、言語、自主神經及心理與神經功能等方面對患者的病情進行評估，分值從正常的0分到嚴重缺損的9分不等。

1.5統計學分析 采用SPSS19.0軟件，計量資料采用獨立樣本t檢驗和Spearman非參數檢驗，等級資料采用秩和檢驗。

2 結 果

2.1兩組外周血中Th22、Treg細胞的比較 與對照組相比，MS組外周血中Th22細胞所占比例升高，Treg細胞所占比例下降，差異均具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組外周血中Th22、Treg細胞百分比比較

2.2兩組血漿中IL-22和IL-35的表達水平比較 MS組IL-22的表達顯著高于對照組(P<0.05)，IL-35水平顯著低于對照組(P<0.05)，差異均有統計學意義，見表2。

表2 兩組血漿中IL-22和IL-35的表達水平比較

2.3Th22細胞和Treg細胞與MS患者病情的關系 MS組EDSS評分為0.0～8.5分，平均(3.09±0.87)分。隨著EDSS評分升高，MS傷殘程度逐漸嚴重，外周血中Th22細胞所占比例不斷增加，Treg細胞所占比例不斷減少，且兩種細胞在不同EDSS評分的組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。MS患者外周血中Th22細胞與Treg細胞所占百分比無明顯相關性(r=-0.222,P=0.445)。

表3 不同程度MS患者外周血中Th22和Treg細胞比例分布

3 討 論

MS發生原因主要是自身免疫系統攻擊神經中樞，引起神經軸突的髓鞘蛋白發生免疫反應，造成脫髓鞘，甚至神經元和軸索遭到破壞，最終導致神經傳導受阻進而造成殘疾。MS是一種炎性疾病，因此，介導機體免疫反應及炎性因子分泌的淋巴細胞成為MS發生發展的主要研究對象。在MS發病機制研究中，早期認為Th1細胞是MS的主要致病淋巴細胞，其在炎癥部位高表達，由Th1細胞分泌的干擾素(IFN)-γ、轉化生長因子(TGF)-β等促使炎癥反應加重，導致組織損傷加重〔7〕。然而，隨著Th17細胞的發現，改變了有關MS發病機制的傳統觀念，不斷有研究顯示不僅Th1/Th2細胞在MS中發揮作用，Th17、Th22、Treg及記憶T細胞等均有與MS相關性的報道〔8〕。

Th22細胞是由Schmidt等發現的以IL-22為主要標志因子，獨立于Th1、Th2及Th17的CD4+T細胞亞群。Th22細胞是一種穩定的淋巴細胞亞群，不易向其他亞群分化，主要分泌IL-22、TNF-α及IL-10，其中機體內的IL-22有37%～63%由Th22細胞分泌〔9〕。IL-22屬于IL-10家族的一員，主要依靠IL-10R2及IL-22R1發揮作用，在體內能夠激活酪氨酸激酶/信號轉導及轉錄激活因子(JAK/STAT)通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的三條細胞信號通路。有關Th22細胞在免疫性疾病中的調控機制尚不完全明確，但有研究表明在不同程度的疾病中Th22細胞的比例及IL-22的表達量均不相同。劉立民等〔10〕研究指出在原發性免疫性血小板減少癥患者外周血中，Th22細胞的比例顯著高于正常組，經藥物治療后細胞比例有所下降，說明Th22細胞在免疫性疾病中發揮免疫促進作用，加重疾病進程。Perriard等〔11〕表明，不同MS分型患者腦脊液及血液中IL-22和受體結合蛋白的核酸及蛋白水平均高于正常組，且IL-22可以提高星形膠質細胞的存活率。星形膠質細胞是中樞神經中含量最多的膠質細胞，有研究顯示星形膠質細胞在MS中的活化或增生會導致機體產生神經損傷因子，加速MS的發生發展〔12〕。本文與上述觀點一致，再次說明Th22細胞及相關細胞因子IL-22與MS密切相關。

Treg細胞是體內具有免疫抑制功能的T細胞，表型為CD4+CD5+，研究表明只有CD4+CD5high具有免疫調節功能，而CD4+CD5int作為活化的效應T系統無免疫抑制活性，因此Treg細胞在體內的抑制水平與細胞數量及抑制活性有關。翁益云等〔13〕在MS患者外周血CD4+CD5+T細胞檢測中發現，其數量與正常組無顯著差異，但在活動期效應T細胞的數量顯著增加，且Foxp3 mRNA表達顯著降低。FOXP3是特異性表達于Treg細胞的轉錄因子，在Treg細胞發揮免疫抑制活性中起重要作用，多數研究證實其在免疫性疾病中表達降低〔14〕。IL-35是至今發現的唯一一個由Treg細胞分泌且具有限制機體過度免疫應答作用的細胞因子，能夠上調IFN-γ，進而抑制TGF-β誘導的Th17細胞的分化。有研究表明，MS組腦脊液中IL-35水平顯著高于非炎性神經系統疾病患者，且MS復發期IL-35的表達明顯低于緩解期，具有反饋性抗炎作用〔15〕。結合本研究結果，說明機體Treg細胞和IL-35下降，進而導致機體相關免疫抑制活性下降，可能是MS發生的原因之一。

綜上所述，患者外周血中Th22細胞百分比升高和Treg細胞百分比下降，引起胞內相關細胞因子表達水平改變，使得機體免疫應答增強，免疫抑制功能減弱，進而加重炎癥反應導致炎性細胞浸潤、髓鞘破壞可能是導致MS發生發展的主要原因。針對以上發病機制，可以在臨床研究中以此作為靶點，采取不同的措施，干預機體免疫應答，以期緩解病情，為MS的治療提供重要的臨床依據。