HER2及CD44v6在膀胱尿路上皮癌中的表達及意義

黎美仁 路名芝 鄭美蓉 周 燕

(九江學院附屬醫院病理科，江西 九江 332000)

傳統對于膀胱尿路上皮癌(UCB)患者的治療，常采用化療、手術切除或是二者結合，隨著大家對UCB發病機制及其生物學行為研究的不斷深入，人們把更多的目光投向了以特異性及敏感性高而不良反應少的分子靶向治療。注射用曲妥珠單抗(赫賽汀)在HER2陽性的乳腺癌治療中的巨大成功，讓同樣存在HER2蛋白過表達UCB值得期待，同時UCB中CD44v6異常表達，因此，本研究應用免疫組化及熒光原位雜交方法，對UCB中HER2及CD44v6的表達情況進行檢測，分析HER2、CD44v6與UCB的臨床病理關系。

1 材料與方法

1.1材料 收集2005～2014年九江學院臨床醫學院/附屬醫院病理科手術切除UCB組織標本115例。標本類型包括：膀胱全切及膀胱部分切除標本。其中男88例，女27例；年齡31～83(中位65)歲，年齡≥60歲者76例，<60歲者39例；腫瘤直徑≥2 cm者45例，<2 cm者70例，參照2004年版世界衛生組織泌尿系統病理學和遺傳學診斷標準，高級別57例，低級別58例；存在肌層浸潤者34例，無肌層浸潤者81例；復發者46例，初發者69例；取同期手術的低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤50例、慢性膀胱炎30例。每例標本的病理組織學診斷都經過兩位有主治醫師及以上的病理醫師重新復片、審核。

1.2試劑 濃縮型兔抗人HER2/c-erbB-2單克隆抗體(工作濃度，北京中杉金橋生物公司，克隆號：EP3)；濃縮型兔抗人CD44v6單克隆抗體(工作濃度，福州邁新生物公司，克隆號8F10)；HER2基因擴增檢測試劑盒(北京金菩嘉醫療科技公司)；MaxVision試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑均購自福州邁新生物公司。

1.3方法 所有標本經10%中性緩沖甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm，于二甲苯及梯度乙醇溶液中脫蠟水洗。免疫組化采用MaxVision法，應用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照，已知陽性片作為陽性對照，按照試劑說明書進行操作。HER2熒光原位雜交(FISH)檢測步驟，將已脫蠟水洗的組織切片放入沸水煮20～30 min，再經37 ℃胃酶消化15 min，滴加0.05% 4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，5 min 后在熒光顯微鏡下觀察消化進程，消化完畢后將切片放入檸檬酸鈉緩沖液(SSC)5 min×2，甲醛固定液固定10 min，再放入SSC 5 min×2，梯度乙醇(70%、85%、100%)脫水，晾干。每張切片上滴加適量(5 μl)新鮮配制的HER2熒光標記探針，封片，放入雜交儀83 ℃變性6 min，42℃ 雜交孵育過夜。去封片膠，放入SSC×2泡掉蓋玻片，放入70℃的0.4 SSC 2 min，放40℃的SSC 2 min×2，放入70%乙醇3 min，晾干。加DAPI 復染后，即可放在熒光顯微鏡下觀察信號強度。

1.4結果判定 免疫組化結果由兩位有經驗的高年資病理醫師采用雙盲法獨立閱片做出判斷。HER2蛋白評分標準參照2007版乳腺癌HER2檢測指南〔1〕：0：未見染色或<10%的間質中浸潤性癌細胞呈現不完整的、微弱的胞膜染色；1+：>10%的浸潤性癌細胞呈現不完整的、微弱的細胞膜染色；2+：有兩種情況，第一種為>10%的浸潤癌細胞呈現不完整和(或)弱至中等強度的細胞膜染色，第二種為≤10%的浸潤癌細胞呈現強而完整的細胞膜染色；3+：>10%的浸潤癌細胞呈現強而完整的細胞膜染色。為方便臨床可根據免疫組化結果來決定使用赫賽汀藥物進行靶向治療與否，根據中國抗癌協會乳腺癌診治指南與規范(2013版)，將HER2免疫組化結果為0及1+視為無HER2基因擴增(陰性)；3+視為有HER2基因擴增(陽性)；2+則應在進行FISH檢測確認是否存在擴增。CD44v6結果判讀〔2〕，陽性定位于細胞膜，用半定量的方法對切片免疫組織化學法的染色強度進行評分：無色為0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；再按陽性細胞所占百分比評分：陽性細胞<5%為0 分，5%～25%為1分，26%～50%為2 分，51%～75%為3分，>76%為4分。最終評分=染色程度×陽性細胞所占百分比評分：0分為陰性，<6分為弱陽性，≥6分為強陽性。

HER2熒光原位雜交結果判讀：計數30個細胞大小較一致、胞核邊界清晰完整、DAPI染色鮮艷均質、胞核分散、未有重疊、綠色著絲粒信號清晰可見的雙色信號腫瘤細胞，計算Ration值(Ration值=30個所選腫瘤細胞胞核中紅色信號總數與綠色信號總數的比值)。當Ration值>1.8認定為不存在基因擴增(陰性)；Ration值>2.2認定為存在基因擴增(陽性)；Ration值1.8～2.2之間時，則需重新計數，并計數細胞增至100個，或重新做FISH實驗并按同樣方法計數Ration值來判斷最終結果。

1.5統計學方法 采用SPSS19.9軟件進行χ2檢驗及Fish確切概率法，相關性采用 Spearman 等級相關分析。

2 結 果

2.1HER2和CD44v6蛋白在不同組織中的表達 115例UCB組織中，HER2蛋白表達61例(53.0%)，其中27例1+，9例2+，25例3+；30例慢性膀胱炎組織中HER2蛋白表達均為0；50例低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤HER2蛋白表達18例(36.0%)，其中12例1+，5例2+，1例3+。對存在HER2免疫組化結果為2+的病例進行FISH檢測，發現低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤5例2+例病中FISH結果陽性2例，而UCB9例2+病例中FISH結果陽性5例。統計三組病例HER2的陽性率(即基因擴增率)，試驗組膀胱尿路上皮癌為26.1%(30/115)，對照組慢性膀胱炎為0%，低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤為6%(3/50)，各組間HER2陽性率有統計學意義(P<0.05)。

115例UCB患者中，CD44v6陽性63例(54.8%)，其中弱陽性17例，強陽性46例；30例慢性膀胱炎患者中CD44v6陽性2例(4.7%)，均為弱陽性；50例低度惡性潛能的乳頭狀尿路上皮腫瘤患者中CD44v6陽性13例(26.0%)，強陽性8例，弱陽性5例。各組間CD44v6陽性率差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2HER2和CD44v6陽性表達與UCB臨床病理特征的關系 115例UCB不同性別、年齡組HER2陽性率差異無統計學意義(χ2=2.194，P=0.139，χ2=0.951，P=0.329)；不同腫瘤大小(χ2=9.982，P=0.002)、不同腫瘤級別(χ2=6.780，P=0.009)、不同肌層浸潤(χ2=5.700，P=0.017)、是否復發病例(χ2=4.698，P=0.030)組間HER2陽性率差異均有統計學意義，見表1。115例UCB中CD44v6陽性率在不同性別(χ2=1.638，P=0.201>0.05)、不同年齡(χ2=1.087，P=0.297)、不同腫瘤大小(χ2=0.018，P=0.894)組間差異無統計學意義、不同腫瘤級別(χ2=9.502，P=0.002)、是否肌層浸潤組間差異有統計學意義(χ2=7.401，P=0.007)；是否復發組間差異無統計學意義(χ2=0.211，P=0.646)。見表1。

表1 HER2、CD44v6陽性表達與UCB臨床病理特征的相關性(n)

2.3相關性分析 在115例UCB組織中，HER2及CD44v6陽性者11例，二者同時陰性者33例，HER2陽性同時CD44v6陰性者19例，HER2陰性同時CD44v6陽性者52例，相關性分析結果提示，HER2 與 CD44v6 表達存在負相關(r=-0.216，P=0.02)。

3 討 論

1987 年，Slamon 等〔3〕首先報道了HER2蛋白在人類乳腺癌的癌細胞中高強度表達。通常情況下，HER2多只在胎兒階段表達，成年后鮮有表達。HER2是一種原癌基因，編碼1型酪氨酸蛋白激酶(TPK)生長因子受體，是表皮生長因子受體(EGFR)家族的重要成員。該家族成員還包括HER1(EGFR)，HER3，HER4〔4，5〕。HER2基因位于17號染色體長臂第二區第一帶(17q21)，編碼產物為185×103 的一種跨膜糖蛋白，P185。但目前尚未發現可與 HER-2 配體結合區結合的特定配體，EGFR 家族的其他成員均發現有與其結合的特定配體〔4〕。

研究發現，HER2基因擴增的機制復雜，但主要是通過HER2和EGFR(HER1)二者之間的協同效應，間接地與配體結合，從而形成二聚體(同源或者異源)；通過直接使HER-2胞內羧基片段的酪氨酸殘基發生磷酸化，激活HER2〔5〕。HER2的激活又磷酸化下游的信號轉導蛋白，激活各種各類信號轉導通路，從而引發級聯的信號轉導，影響腫瘤細胞的增殖、轉化。其介導Ras/Raf/MEK/EPK，PI3K/AKT，PLC2γ/PKC，STAT 等信號通路，過程非常復雜。Ras/Raf/MEK/EPK 信號轉導途徑是在形成HER2磷酸化同源或異源二聚體后，HER2胞內羧基端的酪氨酸殘基與下游的信號蛋白GRB2的SH-2區相結合，之后再與細胞膜內的鳥嘌呤核苷酸交換因子(SOS)作用，將 Ras-GDP磷酸化成 Ras-GTP，使得Ras蛋白得以激活，Ras蛋白誘導磷酸化Raf 激酶，最終使絲裂原活化蛋白激酶(MAPK，MEK)激活，MAPK被激活的信號隨后傳導至胞核內，磷酸化各類轉錄因子如 c-myc，c-fos 等，轉轉錄活性得到加強，從而使機體對細胞的增殖、凋亡的調控機制失效〔6〕。PI3K/AKT 途徑HER-2 蛋白磷酸化，PI3K得以激活，磷脂酰肌醇被誘導成為PIP2、PIP3(胞內的第二信使)，進而激活下游的蛋白激酶 Akt，活化后的Akt激酶作用于細胞內的NF-κB、凋亡抑制因子Bad、p21 基因、p53 基因等，使細胞不能正常生長及凋亡，進而使細胞的增殖和凋亡失去調控〔7〕。另外值得注意的，HER2異源二聚體減少了EGFR 與 cab-1 間的耦聯，EGFR被細胞溶解酶水解的數量隨之減少，造成EGFR細胞膜的表達數量增加，進而使得更多的信號通路得以激活〔8〕。HER-2 基因可通過激活血管內皮生長因子(VEGF)轉錄水平的啟動子，使其在mRNA和蛋白表達水平得到提高，進而使更多的營養腫瘤的新生血管形成〔9〕。

膀胱癌中HER2蛋白的陽性表達率僅只低于乳腺癌及胃腸癌，是常見的具有HER2高表達的人類惡性腫瘤。源于實驗室條件及所用抗體克隆號不同，各類研究結果出現較大差距，研究數據顯示的HER2蛋白表達率從23%～80%不等，而基因擴增百分比范圍在0～30%〔10～16〕。本研究結果，與文獻基本相符，印證了膀胱癌中HER2的確存在過表達。通常異常激活HER2蛋白方式有兩種：基因擴增或基因突變。基因擴增為大多數人熟悉，乳腺癌中HER2蛋白表達，多由基因擴增所致，甚至有人認識95%乳腺癌HER2過表達均有基因擴增引起〔17〕。而基因突變則是由于各種原因導致HER2蛋白的一些特點位置發生突變導致它異常激活。研究發現〔4〕位于HER2的原癌基因膜內區664位纈氨酸被谷氨酸取代，造成HER2癌基因形成。這種改變加強了分子間的氫鍵作用，使HER2因更容易形成二聚體而被激活。本研究發現膀胱癌中由非基因擴增導致蛋白過表達為36.8%，這部分很可能由基因突變所致。而Simonetti等〔18〕發現有一些HER2蛋白異常表達源于17號染色體出現了多倍體，而非基因擴增導致。

UCB患者可發生在任何年齡段，但多為中老年男性，也偶見兒童患者的報道，本研究顯示UCB患者年齡及性別間差異對UCB組織中HER2陽性與否不存在直接關聯。隨著患者腫瘤的體積增大，HER2的陽性表達率隨之提高〔19〕。本研究結果顯示，UCB患者腫瘤最大徑越大，其HER2陽性表達率則越高。同樣胡文輝等〔20〕在檢測一組73例膀胱癌的研究中，發現腫瘤直徑>3 cm與直徑≤3 cm之間HER2陽性表達率差異有統計學意義。可以看出，患者腫瘤的大小對HER2的表達有直接影響。本研究顯示隨著腫瘤級別不斷升高，HER2陽性率也在不斷升高。Coogan等〔13〕發現UCB中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的HER2蛋白表達率分別為14%、12%及48%。顯而易見，HER2的陽性率受腫瘤的惡性程度影響。腫瘤浸潤越深，HER2陽性率越高。本研究顯示HER2陽性率在有無肌層浸潤組間差異有統計學意義。Coogan等〔13〕發現Ta與T1期UCB中17%HER2蛋白陽性，而T2及T3的表達率為44%。更有報道〔21～24〕稱浸潤性尿路上皮癌中HER2強表達率為41%～81%。腫瘤中HER2表達同樣影響其遠期事件，HER2陽性患者術后復發率較陰性者明顯升高。本研究中復發組與初發組HER2陽性率差異有統計學意義。Raica等〔25〕發現淺表的UCB(Ta、T1)隨訪36月，復發者其HER2陽性率為84.6%，而對應無復發者僅有7.1%。

HER2的表達是否會影響UCB患者的預后，本研究因存在資料不全，失訪而未能統計，無法解釋二者是否存在相關性。目前對于HER2表達對膀胱癌預后的是否有影響存在分歧。Coombs等〔26〕則認為，雖然HER2的過表達為膀胱癌提供了分子標志，但作為潛在的預后指標有待進一步研究。Masliukova 等〔27〕通過一系列的回顧性研究發現，HER2陽性UCB患者無瘤生存期明顯低于陰性患者；以此同時，Kruger等〔22〕發現相對于HER2陰性患者，HER2過表達患者的疾病相關生存更短，因此他們認為HER2可以視為UCB的獨立預后指標。本研究結果同樣顯示HER2蛋白陽性患者更易復發。目前，臨床對膀胱癌患者的預后評估判斷主要還是依據其腫瘤的臨床病理分級、分期，HER2能否作為膀胱癌的獨立預后指標，還有待于進一步研究發現。對乳腺癌的研究表明，曲妥珠單抗對伴有HER2 基因擴增的乳腺腫瘤的治療取得了巨大成功舉世關注，而且現在以HER2位靶點的藥物也已開始應用于胃腸癌的臨床治療〔28，29〕。針對HER2基因的分子靶向治療是否適用于膀胱癌，能給膀胱癌患者帶來福音嗎？邱學德等〔30〕人發現酪氨酸激酶抑制劑PD168393對HER2高表達的膀胱腫瘤細胞表現出較好的抗腫瘤活性。Kolla 等〔31〕指出赫賽汀、紫杉醇和順鉑等常用的輔助治療藥物，在對膀胱癌癥患者和轉移性病例的治療上，它們之間具有有協同作用。可以看出，靶向藥物在HER2陽性的膀胱癌治療上有一定幫助，但還需待大宗實驗數據來證實。

CD44，是一種廣泛分布的單鏈表面蛋白〔32，33〕。人類的CD44基因位于11號染色體短臂上，全長50～60 kb，由20個外顯子、19個內含子及選擇性剪接插入的外顯子構成〔34〕，外顯子的長度在70～210 kb之間，外顯子又分為組成型和變異性，分別各10個，他們之間由大小不等的內含子分隔。根據所含外顯子的構成不同，分為標準型CD44(即CD44s)及變異型CD44(CD44v)。CD44s所含的10個外顯子全部由組成型構成，所編碼的蛋白包含361個氨基酸，理論分子量為90 kD。而CD44v則是在CD44s的基礎系列中選擇性剪接插入了其他外顯子〔35〕，根據插入部位及外顯子類型不同，分為10種異型(CDv1～CD44v10)〔36，37〕。其中，CD44v6是常見的一種CD44變異異型，與人類腫瘤密切相關，是在CD44s的胞外結構域插入變性拼接的V6外顯子構成，所編碼的跨膜糖蛋白含有43個氨基酸。

CD44分子，是機體一種常見黏附分子，分布于人體各種各類細胞的胞膜表面，介導細胞與細胞間、細胞與基質間的識別過程〔38〕。CD44分子作為淋巴細胞“歸巢”受體參與淋巴細胞的激活及再循環，主要激活T細胞及NK細胞，并介導了淋巴細胞在體液中的運動。同樣，也可參與細胞之間的各種信號傳導，加快細胞有絲分裂，增強細胞表達各種因子及受體的能力，進而使機體細胞免于凋亡〔39，40〕。而CD44與相應的細胞骨架蛋白結合，則可促進偽足形成，對細胞形態及運動進行調控，加速其轉移，促進腫瘤侵襲及進展〔41〕。另外，它也有調節機體對藥物的吸收及機體對藥物的敏感性、調節細胞通道、中和透明質酸及更新間質成分的作用。有學者認為某些CD44分子的高表達可促進惡性腫瘤的轉移〔42，43〕。CD44v6作為CD44的一種特殊亞型，同樣具有可以和透明質酸結合的膜外區，是其發揮生物功能的結構。CD44v6與腫瘤之間可能通過下面途徑發揮作用：一方面，促進基質金屬蛋白酶降結細胞外Ⅳ型膠原，使得腫瘤細胞不受基底膜的束縛，更易在間質中游走，提高了腫瘤細胞的侵襲力〔44〕；另一方面，促進黏著斑酶磷酸化，進而介導CD44內外的信號傳導，激發其下游信號通路，使得PI3K/Akt信號通路和MAPK途徑得以激活，進而加速腫瘤細胞分裂及增殖，抑制腫瘤細胞凋亡。此外，CD44v6可以通過模擬活化的淋巴細胞生物學特征，使得其可以具有與淋巴細胞類似的歸巢運動，從而達到4“欺騙”人體的免疫系統，逃避免疫細胞及免疫因子識別和殺傷，讓腫瘤細胞更易在淋巴結轉移。

目前多數研究結果指出，UCB中存在CD44v6蛋白的過量表達，而在對應癌旁正常組織中表達量極低或不表達。王永輝等〔45〕應用免疫組化檢查一組85例胃癌標本組織中CD44v6的表達率為43.5%，而癌旁膀胱組織為陽性率為17.1%，二者差距明顯，同時，其的表達強度與腫瘤級別、腫瘤浸潤深度及是否淋巴結轉移關系密切。Afify等〔46〕在研究乳腺癌研究中，發現浸潤性乳腺癌中CD44v6蛋白陽性表達率高達94%，而正常乳腺組織為陰性，淋巴結中轉移的癌細胞100%表達。安慧敏〔47〕在研究一組72例結直腸癌標本的病例中發現，其CD44v6的陽性例數高達54例，且隨臨床病理分級呈正相關。綜合以上研究結果，可明確得出結果，即CD44v6不僅在腫瘤組織存在高表達，而且或直接或間接參與了腫瘤的形成、浸潤以及轉移。

大量研究及實驗結果提示〔48～51〕，UCB中存在CD44v6蛋白的過量表達，表達率大致在50%～90%之間，本研究實驗CD44v6的陽性率為54.8%，以文獻報道基本相符，略偏低，可能與試驗選用的抗體相關，本研究選用的單克隆抗體，敏感性相對較弱，而特異性則較強，同樣實驗組病例組成對實驗結果也存在一定影響。李沐寒等〔2〕在研究一組54例復發性膀胱尿路上皮中發現，CD44v6表達與性別與年齡無相關性，本實驗顯示了相同的結果。于勝強等〔52〕在研究71例UCB患者CD44v6的表達時，得出同樣的結果。目前多數學者認為〔53～55〕，UCB中CD44v6的表達水平與其臨床病理分級及分期呈負相關。Sugino等〔53〕認為在早期UCB中CD44基因高表達，而其丟失與腫瘤細胞獲得侵襲性相關。Hong等〔54〕報道CD44v6 在病理分級越高，膀胱癌中表達越低，存在肌層浸潤的膀胱腫瘤患者出現CD44v6過量表達時，預后相對較好。Lipponen等〔55〕進行一組173例膀胱移行細胞癌病例組成的回顧性研究，結果提示腫瘤的分級、分期與其腫瘤細胞中CD44V6蛋白的表達量呈負相關，而患者的生存率則與其表達強度呈正相關性。同時，也有一些學者〔49，56〕發現，隨著UCB中CD44v6的陽性表達率升高，其臨床病理分級分期隨之升高。本文及相關研究結果支持CD44v6隨著臨床病理分級及分期的升高而降低，呈負相關。對于CD44v6對復發的影響，存在爭議，有人認為〔49〕UCB中CD44v6表達水平越高，復發率越高。Matuschek等〔57〕同樣認為CD44v6 mircoRNA表達過少與膀胱癌生存期延長相關。而李志強等〔51〕研究CD44v6的表達量與UCB患者有無復發、無瘤生存期及5年生存期三者之間不存在相關性，不能作為它的獨立預后因子進行評估。本研究結果支持后者。

目前，對CD44v6與HER2相互關系的研究較少，多數在消化道癌，乳腺癌及腦腫瘤等，而罕有二者在膀胱癌中的相互作用的報告。Bao等〔58〕發現胃癌里CD44可直接與HER2結合，使得轉移相關蛋白1表達增加，進而誘導組蛋白H3賴氨酸9形成，抑制microRNA-139的轉運翻錄，從而使趨化因子受體4的表達水平上調，進而使腫瘤細胞浸潤及轉移。王永輝等〔45〕在研究胃癌中CD44v6和HER2的表達時，發現二者同時表達組之外的其他比較組中二者均逐漸升高，經統計學分析有意義，而癌旁組織中卻未見上述改變，提示在胃癌細胞的增殖方面，HER2和CD44V6二者相互起協調作用。Ghatak等〔59〕報道，CD44與透明質酸酶相互作用可以起到活化HER2的作用，這在對結腸癌及乳腺癌研究都得到證實。本研究結果提示HER2與CD44v6可能在UCB的發生、發展過程中共同起作用。