轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的設(shè)計(jì)和流程簡述

沈兆瑞

(天津市武清區(qū)楊村第一中學(xué) 天津 301700)

1 教材分析

“基因工程”是人教版高中生物學(xué)教材中(必修2)第六章以及(選修3)專題一的內(nèi)容，主要是圍繞著轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的基本操作程序展開： 包括“目的基因的獲取”“基因表達(dá)載體的構(gòu)建”“將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞”和“目的基因的檢測與鑒定”。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的流程繁瑣且遠(yuǎn)離日常生活，以至于學(xué)生對(duì)上述步驟的認(rèn)知常停留在記憶層面。因此，教材中建議“有條件的地方，嘗試讓部分學(xué)生參與轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)并介紹給其他學(xué)生”。本文以此為出發(fā)點(diǎn)，帶領(lǐng)學(xué)生設(shè)計(jì)并開展一次完整的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)，并以講座形式進(jìn)行流程簡述，以深化學(xué)生對(duì)教材知識(shí)的理解及應(yīng)用。

2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 受體植株的選擇——擬南芥 擬南芥(Arabidopsisthaliana)屬十字花科植物，在中國的華東、中南和西北等地廣泛分布，一般生長于山坡、平地、河邊以及路邊。由于具備生長周期短、繁殖系數(shù)高和基因組小等優(yōu)點(diǎn)，因此被作為模式生物廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域中[1]。

2.2 目的基因以及相關(guān)元件的選擇 具體如下：

(1) 目的基因 選取綠色熒光蛋白(GFP)基因作為目的基因，并在其上游連接一段的信號(hào)肽序列(signal peptide，簡稱sp)，后者可幫助GFP定位于線粒體中，方便后續(xù)的檢測與鑒定。

(2) 啟動(dòng)子 選擇在雙子葉植物中廣泛使用的組成型啟動(dòng)子CaMV 35S，用于驅(qū)動(dòng)目的基因的高效表達(dá)。

3 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 構(gòu)建重組質(zhì)粒 具體如下：

(1) 構(gòu)建基因表達(dá)載體 利用工具酶，依次將啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列和目的基因連接成一段DNA序列(圖1A所示)，其上下游分別攜帶BamH I與KpnI酶切位點(diǎn)，方便與普通質(zhì)粒(圖1B所示)重組。利用雙酶切法同時(shí)處理目的基因與普通質(zhì)粒，連接后獲得重組質(zhì)粒(圖1C所示)。

(2) 轉(zhuǎn)化 將上述連接產(chǎn)物導(dǎo)入處于“感受態(tài)”的大腸桿菌中，所得的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要分為三類： 絕大多數(shù)為空白的感受態(tài)細(xì)胞，少數(shù)細(xì)胞成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒。除此之外，還存在普通質(zhì)粒自連所造成的干擾。

(3) 抗性篩選 將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至含有氨芐青霉素(Amp)的培養(yǎng)基中進(jìn)行初步篩選，得到含有標(biāo)記基因的大腸桿菌單克隆菌落。

(4) PCR鑒定 為了進(jìn)一步排除普通質(zhì)粒的干擾，利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行檢測。通過DNA凝膠電泳觀察顯示，除去4/7/8組外，其余各組均獲得擴(kuò)增條帶，表明成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒(如圖1，D所示)。

(5) 提取質(zhì)粒 任取一組成功導(dǎo)入重組質(zhì)粒的單克隆菌落進(jìn)行二次擴(kuò)培，提取重組質(zhì)粒備用。

圖1 構(gòu)建重組質(zhì)粒

3.2 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 農(nóng)桿菌侵染作為一種天然的植物轉(zhuǎn)化體系，在雙子葉植物的應(yīng)用中尤為常見。農(nóng)桿菌細(xì)胞質(zhì)中的Ti質(zhì)粒內(nèi)含一段T-DNA序列，侵入植物體后，該序列會(huì)隨機(jī)插入植物細(xì)胞的染色體組中，產(chǎn)生可遺傳變異。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌“感受態(tài)”細(xì)胞中，經(jīng)過轉(zhuǎn)化、抗性篩選、PCR鑒定等步驟(同上文，不作贅述)獲取攜帶重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，在28℃下擴(kuò)培后備用。

本實(shí)驗(yàn)采取花序浸泡法，讓攜帶目的基因的農(nóng)桿菌侵染擬南芥子房內(nèi)部的胚珠(將發(fā)育成種子)，使子代獲得相應(yīng)性狀。選取生長狀態(tài)良好的擬南芥植株，待花序發(fā)育至適宜階段后，剪除已成熟角果與已授粉花，并在24h后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在此期間，將二次擴(kuò)培的農(nóng)桿菌與等滲溶液(常用蔗糖溶液)混勻，制備農(nóng)桿菌懸濁液備用。將經(jīng)過剪切后的花序浸泡入上述懸濁液中，帶有T-DNA序列的農(nóng)桿菌通過侵染進(jìn)入植株體內(nèi)并完成轉(zhuǎn)化。對(duì)轉(zhuǎn)化后植株進(jìn)行避光和密閉保濕處理，24h后解除并移至適宜環(huán)境下生長。

3.3 目的基因的檢測與鑒定 一般將農(nóng)桿菌侵染的植株命名為T0代，其子代多數(shù)為正常植株(未成功轉(zhuǎn)化)，少數(shù)轉(zhuǎn)化成功的植株被命名為T1代。花序浸泡法操作簡便，但轉(zhuǎn)化效率相對(duì)偏低。因此，必須利用抗性篩選來獲取成功導(dǎo)入目的基因的T1代。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)選取的農(nóng)桿菌攜帶潮霉素抗性基因，所以使用含有潮霉素的植物生長培養(yǎng)基對(duì)T0代的種子進(jìn)行篩選。潮霉素對(duì)幼苗生長有明顯抑制作用，僅有成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌的T1代幼苗能夠正常生長發(fā)育。

綠色熒光蛋白(GFP)受到藍(lán)光照射時(shí)，會(huì)吸收能量并激發(fā)出綠色熒光。依據(jù)該特性，GFP常被生物學(xué)家作為標(biāo)記蛋白，用于觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白分子的動(dòng)態(tài)變化[2]。本實(shí)驗(yàn)可通過觀察T1代幼苗的綠色熒光水平，來進(jìn)一步檢測與鑒定目的基因的表達(dá)情況。檢測結(jié)果表明，在擬南芥幼苗的根、莖和葉中均能檢測到綠色熒光信號(hào)。進(jìn)一步通過酶解處理，獲取單個(gè)原生質(zhì)體后在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)GFP集中分布于線粒體中。上述結(jié)果均表明目的基因成功導(dǎo)入了T1代幼苗中并正確表達(dá)，該幼苗確為轉(zhuǎn)基因植株，本次轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)流程完成。

4 實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新

本實(shí)驗(yàn)利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法成功將目的基因?qū)胧荏w植株中并表達(dá)。通過流程簡述，學(xué)生從整體上對(duì)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的步驟有了更加直觀和感性的認(rèn)識(shí)。此外，實(shí)驗(yàn)中對(duì)相關(guān)技術(shù)的具體應(yīng)用也拓展了學(xué)生的思路。

例如，PCR技術(shù)鑒定目的基因的導(dǎo)入和熒光標(biāo)記法檢測目的基因的表達(dá)等。由此可見，生命科學(xué)離不開實(shí)驗(yàn)，高中生物學(xué)教師應(yīng)引導(dǎo)學(xué)生通過實(shí)驗(yàn)來感受生物學(xué)這門學(xué)科的魅力所在。