“探究pH對酶活性影響”實驗的拓展

王永梅 張 鋒

(1 福建省漳州市第一中學 漳州 363000； 2 福建省普通教育教學研究室 福州 350003)

1 引言

“探究影響酶活性的因素”是人教版高中生物學必修1第5章第1節第2課時的內容。該實驗一方面可加深學生對酶作用和酶本質的深入理解，同時也為光合作用和呼吸作用的學習做知識和實驗探究的鋪墊。在完成教材實驗后，學生提出一些在探究實驗中產生的疑問： 如何使肝臟研磨液中的酶活性保持更久？在中學現有條件下，有沒有較為簡便的方法能達到多設幾個pH梯度的目的？是否有其他快速簡便檢測影響酶活性因素的方法？圍繞這些問題，教師引導學生進行進一步的探索。將高中生物學拓展實驗中固定化酶技術、逐級稀釋法等應用于該實驗，并在此基礎上應用尿糖試紙進行pH對酶活性影響的實驗探究。

2 實驗原理與方法

2.1 肝臟過氧化氫酶固定 固定化酶技術是通過化學或物理的處理方法，使原來水溶性的酶與固定態的水不溶載體相結合或被載體包埋。傳統的固定化酶技術可分為吸附法、共價鍵結合法、交聯法、包埋法。本實驗運用吸附法固定肝臟過氧化氫酶。將干凈、干燥的濾紙片放入潔凈托盤，倒入新鮮肝臟研磨液，靜置一段時間后取出濾紙晾干，剪成4cm×4cm大小備用。

2.2 逐級稀釋法配置HCl和NaOH溶液 實驗需要配置不同pH的酸堿溶液。該過程操作繁瑣。借用化學試劑配制的逐級稀釋法可極大簡化操作。分別以100mL的5%HCl和10%NaOH為母液；取10mL母液，加入90mL蒸餾水，配制成稀釋10倍的B試液；再取10mL B試液稀釋到100mL，配制成稀釋100倍的C試液(由于未配置pH計，采用pH試紙進行測定，結果顯示試液pH呈現明顯的梯度變化)。

2.3 市售尿糖試紙 尿糖試紙是采用固定化酶技術制成的商品化產品，用來檢查尿糖患者尿糖情況的專用試紙。根據葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下形成葡萄糖酸和過氧化氫，H2O2在過氧化氫酶的催化作用下形成水和原子氧，以及原子氧可以將某種無色的化合物氧化成有色的化合物的原理，將上述兩種酶和無色化合物固定在紙條上，制成測試尿糖含量的酶試紙。商品化的尿糖試紙購買方便，均一性強，批次間差異小，可用于替代含新鮮肝臟研磨液的濾紙片。

3 結果與分析

3.1 固定化酶技術在探究pH對過氧化氫酶活性影響實驗中的應用 先將等面積的含酶濾紙片分別放入相應梯度pH試液及蒸餾水中處理相同時間(5min)，夾出轉移至對應的潔凈培養皿中，往上面滴加等量3% H2O2溶液，1min后觀察產生氣泡的量并記錄。

表1 梯度pH條件下的過氧化氫酶活性檢測

(注： -代表沒氣泡，+表述產生氣泡的量)

結果顯示(表1)，5%HCl處理組沒有氣泡產生(記為“-”)；蒸餾水處理組有大量氣泡產生(記為“++++”)；10%NaOH處理組有少量氣泡產生(記為“+”)。由此可見酸或堿會極大影響過氧化氫酶的活性，酸對過氧化氫酶的影響大于堿。

取室溫保存2d和7d的含酶濾紙片做酶活性的對比實驗，發現兩者都產生大量氣泡，說明含酶濾紙片室溫(福建9月的平均氣溫在37℃以上)保存一周仍具有較高活性。

3.2 逐級稀釋法配置不同pH梯度的HCl和NaOH溶液 運用逐級稀釋法對質量分數為0.1g/mL的NaOH和體積分數為5%的HCl進行10倍倍比稀釋，用pH試紙進行測定，與標準比色圖譜比較，記錄結果(表2)。

表2 逐級稀釋法配置不同pH梯度溶液的可行性研究

通過逐級稀釋，溶液pH確實呈現梯度變化，借助此方法可輕松準確配置一系列pH梯度的溶液，解決配液難的問題。

3.3 尿糖試紙檢測pH對過氧化氫酶活性影響實驗 尿糖試紙上吸附有過氧化氫酶。未使用的尿糖試紙是淡藍色的。10個小燒杯中，各加入1mL 3% H2O2溶液，按照表3加入對應滴數的5% HCl和5% NaOH，搖勻后將尿糖試紙放入，30s后取出，與瓶簽上的標準比色圖譜比較，記錄結果(表3)。

表3 尿糖試紙替代含酶濾紙片的初步研究

(注：“+”越多，棕色越深，說明酶活性越高；“-”代表沒反應，說明酶活性喪失)

若反應體系中有氧氣產生，則試紙轉變為棕色，棕色越深，代表氧氣產生量越大，過氧化氫酶的酶活性越高。試紙顯色結果明顯顯示出加入不同滴數的酸溶液或堿溶液對過氧化氫酶活性的影響。加入3滴5% HCl后基本沒有反應，酶活性變化很大。5% NaOH溶液對酶活影響較酸小很多，但也能明顯影響酶活性。這與含酶濾紙片進行的實驗結果相吻合，說明尿糖試紙的替代性使用是可行的。

4 討論

含酶濾紙片制備簡單方便、快捷、均一性良好，保存簡單。用于教材實驗效果顯著，免去溶液混合的步驟，保證實驗在預設pH下進行，有效控制單一變量。整個實驗在濾紙片上進行，避免手部直接接觸強酸強堿，安全性高。保存7d的濾紙片一開始產生氣泡的速度較慢，但不影響整體實驗結果的判斷，可以較好滿足班級多、實驗周期長的需求。

商品化的尿糖試紙購買方便，價格實惠，均一性強，批次間差異小，可用于替代含新鮮肝臟研磨液的濾紙片，省去購買肝臟、制備研磨液、制備含新鮮肝臟研磨液的濾紙片等步驟，買來即可使用，2～3min出結果，簡化操作。尿糖試紙的使用，將原實驗氣泡的觀察，轉變為比色，更加直觀。由于反應體系小，通過優化操作，讓實驗更加科學。通過實驗，筆者發現過氧化氫酶的活性較容易受到酸性條件的影響，而在堿性條件下能保持較高活性，推測過氧化氫酶的最適pH偏堿。

在此基礎上，引導學生利用已經梯度稀釋的酸堿和H2O2溶液進行不同pH條件下酶活性的探究，小組內成員合作，短時間內完成多個梯度pH下酶活性的探究。不同小組間平行重復實驗，幾分鐘內便可得到大批準確的實驗結果，極大提高了課堂效率。學生通過操作體驗學習到課本以外的科學方法，豐富了知識，提高了實驗技能。