槐果堿抗心律失常的電生理機制研究

董揚　張芬　王文標

[摘要] 目的 探討槐果堿對心肌細胞動作電位（action potentials，AP）及離子電流的電生理效應。 方法 將豚鼠心臟快速取出后通過心電圖記錄心臟對槐果堿的應答；采用常規微電極技術對豚鼠乳頭狀肌或兔竇房結細胞快反應及慢反應動作電位進行記錄，研究槐果堿的相關效應；獲取新生大鼠心室心肌細胞進行原代培養，采用膜片鉗技術記錄全細胞及單通道電流；采用穿孔膜片鉗技術進行全細胞鈣流記錄。 結果 在異丙腎上腺素誘導后出現心動過速，而槐果堿（300 μmol）加入后，心動過速或室顫現象消失，心電圖提示出現正常心跳。對于豚鼠心室心肌細胞的快反應動作電位，槐果堿作用后，APD及動作電位的有效不應期延長，APA下降。對于竇房結的慢反應動作電位，槐果堿處理后，APA及Vmax均出現下降，且APD90也能夠延長。結果顯示槐果堿通過阻斷Ikr而非Iks實現對APD的延長。新生大鼠心室細胞的細胞電流實驗結果顯示10 μmol/L槐果堿能夠導致INa下降約18%。且槐果堿能夠在全體細胞水平上降低慢內向電流，尾部電流（外向K+電流）也出現消失，相比于對照組，ICaL在20 mV指令電位時，平均減少（33.2±11.7）%。 結論 槐果堿能夠逆轉異丙腎上腺素引起的心律失常，其作用機制為抑制Na離子、鈣離子及鉀離子電流。

[關鍵詞] 槐果堿；心肌細胞；動作電位；離子電流

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）19-0026-05

Study on the electrophysiological mechanism of sophocarpine against arrhythmia

DONG Yang ZHANG Fen WANG Wenbiao LIU Jun

Department of Cardiology， Jinhua Peoples Hospital in Zhejiang Province， Jinhua 321000， China

[Abstract] Objective To investigate the electrophysiological effects of sophocarpine on cardiomyocyte action potentials（AP） and ion currents. Methods The heart of guinea pigs was quickly removed and response of heart to sophocarpine was recorded by electrocardiogram. The conventional microelectrode technique was used to record the fast response and slow response action potentials of guinea pig papillary muscles or rabbit sinoatrial node cells， and the related effects of sophocarpine were investigated； neonatal rat ventricular cardiomyocytes were obtained for primary culture. Patch-clamp technique was used to record whole-cell and single-channel currents； perforated patch-clamp technique was used to record whole-cell calcium flow. Results Tachycardia occurred after isoproterenol induction， and after sophocarpine（300 μmol） was added， tachycardia or ventricular fibrillation disappeared. Electrocardiogram indicated a normal heartbeat. For ventricular cardiomyocytes fast response action potential in guinea pigs， after the sophocarpine was given， the effective refractory period of APD and action potential was prolonged， and APA was decreased. For the slow response action potential of the sinus node， after sophocarpine was given， APA and Vmax were both decreased. APD90 could also be prolonged. The results showed that sophocarpine extended APD by blocking Ikr instead of Iks. The experimental results of cell currents in neonatal rat ventricular cells showed that 10 μmol/L sophocarpine could cause INa to decrease by about 18%. Moreover， sophocarpine could reduce the slow inward current at the whole cell level. Tail current（outward K+ current） also disappeared. ICaL was decreased by an average of （33.2±11.7）% at a 20 mV command potential compared to the control group. Conclusion Sophocarpine can reverse isoproterenol - induced arrhythmia. Its mechanism of action is to inhibit the currents of Na+， Ca2+ and K+.

[Key words] Sophocarpine； Myocardial cells； Action potentials； Ion currents

心律失常是由離子通道異常引起的一種疾病，盡管已經被研究多年，其迄今仍為一種能夠導致生命危險的疾病[1-3]。有研究認為心律失常由心臟病導致，如心衰和心肌缺血。心梗患者往往因心動過速或室顫更易出現突發性心臟死亡。目前已有多種藥物被認為能夠用于治療心律失常，然而這些藥物因其相關的副作用如心臟抑制及促心律失常效應而使用受限[4-6]。近來研究提示，能夠避免這些嚴重心臟副作用的天然復合物可能能夠用于心律失常的治療[7-10]。

苦參作為一種中藥在中國已有千年的使用史。其包含多種類型的生物堿，主要有苦豆堿、苦參堿及槐果堿[11，12]。有研究提示苦參具有抗心律失常的效應。Zhang等[13]研究提示從苦參中提煉的槐果堿是一種治療病毒性心肌炎的有效藥物，其不僅具備抗病毒效應，而且同時具備抗心律失常的效應。Chen等[14]研究提示，期外收縮患者在采用槐果堿治療后，有89.7%的患者出現了心律失常恢復的情況。該結果提示槐果堿具有抗心律失常的效應，然而有關其機制尚不明確。在本研究中，通過研究槐果堿對心臟、心肌細胞及離子通道的效應來明確槐果堿的電生理性質并探索其抗心律失常功能的機制。本文中所有涉及到的動物實驗均符合本院動物福利，并獲得動物使用委員會的批準。

1 材料與方法

1.1 溶液配制

用于灌注的臺式液（Tyrodes）溶液的配方如下（mM）：NaCl：138；KCl：5.4；CaCl2：1.8；MgCl2：1；glucose：10；HEPES：10；pH：7.4。用于全部細胞Na+電流記錄的電極液配方如下（mM）：KCl：120；CaCl2：0.1；MgCl2：2；EGTA：1.1；HEPES：10；pH：7.2。水浴溶液采用上述Tyrodes液。用于內向外Na+通道電流記錄的水浴溶液配方如下（mM）：KCl：120；CaCl2：0.1；MgCl2：2；EGTA：1.1；HEPES：10；pH：7.4。電極液配方如下（mM）：NaCl：180；KCl：1.3；CaCl2：1.5；MgCl2：0.5；glucose：5；HEPES：5；CoCl2：3；TEA：10；4-AP：10；CsCl：10；pH：7.2。用于穿孔膜片鉗電極液的配方如下（mM）：K-aspartate：130；MgCl2：2；CaCl2：5；EGTA：1.1；Na-HEPES：10；Na2-ATP：2；pH：7.2。實驗中兩性霉素的使用濃度為240 μM。

槐果堿來自上海醫藥工業研究院。槐果堿注射液購自于上海禾珈藥業公司，注射液濃度為10 g/L。Chromanol 293B購自德國Aventis Pharma公司，采用DMSO溶解至濃度為10 mmol/L。多菲力特（dofetilide）購自于英國EGIS藥物公司。

1.2 離體豚鼠心臟心電圖測試

采用體重為250～300 g的豚鼠（雌雄各半）進行實驗[動物許可證號SYXK（浙）2012-0178]，將豚鼠采用腹腔注射5 mL/kg的20%的烏拉坦溶液進行麻醉。將心臟快速取出后采用Langendorff灌注設備在80 cm水柱壓力下進行記錄。Tyrodes液的溫度維持在37°C。將三個鉑電極分別置于心尖、右心房及主動脈根部位用于心電圖的記錄。采用裝有PowerLab system軟件的電腦進行信號的記錄。

1.3 新生大鼠心室心肌細胞的原代培養

根據之前文獻報道的內容進行[15，16]，采用1日齡的新生大鼠（雌雄各半）進行實驗，將大鼠采用腹腔注射5 mL/kg的20%的烏拉坦溶液進行麻醉。將心臟取出后，將心室切成小塊后，采用含膠原酶的溶液進行消化。離心兩次后從細胞懸液中獲得心肌細胞，將離體的心室肌細胞接種到含有10% 胎牛血清的DMEM培養液的玻璃蓋玻片上生長5～6 d。

1.4 豚鼠乳頭狀肌及家兔竇結節的制備

采用體重為250～300 g的豚鼠（雌雄各半）及體重為1.5～2.5 kg的家兔進行實驗，將動物采用靜脈注射濃度為30 mg/kg的戊巴比妥鈉進行深度麻醉后，通過靜脈放血進行處死。將心臟快速取出后迅速放入充滿Tyroses液的分離槽。將右心室乳頭狀肌肉或含部分左心室的竇結節切碎并以不銹鋼鋼針固定于灌流槽底部。灌流槽維持在37°C情況下，采用3 mL/min的Tyroses液進行灌流。

1.5 快反應及慢反應動作電位記錄

采用雙鉑電極對乳頭狀肌肉及竇房結分別采用頻率為1.1 Hz及2.2 Hz的矩形電流脈沖進行驅動。每次脈沖的持續時間為0.1 ms，強度為閾值的1.5 倍。在刺激30 min后，跨膜動作電位采用浸沒于3M KCl溶液的常規玻璃微電極（其中電極頭部電阻為15～20 MΩ）。通過裝配放大器及PowerLab界面軟件的電腦進行采用和存儲。快反應動作電位的計算參數包括靜息電位（resting potential，RP）、動作電位幅度（amplitude of action potential，APA）、最大去極化速率（Vmax）、動作電位時程（action potential duration，APD）及有效不應期。為了檢測有效不應期，將豚鼠制備物采用頻率為1 Hz的系列脈沖連續刺激8次。在最后一次脈沖后，加入1次其他測試脈沖。通過調節8次脈沖及測試刺激的時間間隔，能夠用以誘導的額外動作電位，最短的時間間隔被記錄為有效不應期。

1.6 膜片鉗實驗

采用膜片鉗技術來記錄全細胞及單通道電流。細胞采用之前提及Tyrodes液進行灌注，流速為3 mL/min。采用穿孔膜片鉗技術進行全細胞鈣流記錄，其優點在于能夠阻斷鈣電流的衰減。灌注液中的4-AP能夠用于阻斷瞬時外向電流（Ito）顯示鈣離子電流。采用示波器及Axopatch-1D放大器來監視和記錄鉗制電壓和通道電流。采用Clampex 9.0 軟件進行數據的采集，通過Digidata1320進行數據記錄。采樣速率為100 kHz、濾過頻率為10 kHz。

1.7 統計學分析

所有數據采用SPSS13.0軟件進行分析。連續性計量資料采用均數±標準差表示。兩組和多組數據比較分別采用t檢驗及方差分析進行檢測。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 槐果堿抗心律失常作用研究結果

在心動過速的模型中，將心臟首先采用含15 μmol/L異丙腎上腺素Tyroses液進行灌注6～8 min。隨后，當心動過速及室顫開始出現后立即進行記錄。隨后將槐果堿加入到上述灌注液中。11～17 min后，心動過速或室顫現象消失，心電圖提示出現正常心跳。本實驗共重復6次。全部豚鼠均在異丙腎上腺素誘導后出現心動過速，而槐果堿加入能夠抑制心動過速。異丙腎上腺素能夠將心率從（175±23）次/min增加到（218±26）次/min，從而引起心動過速的出現，而槐果堿能夠將心率恢復到（179±24）次/min并最終使心動過速停止。將槐果堿洗去后能夠將心率恢復到（207±28）次/min。

2.2 槐果堿對心室細胞快反應動作電位的效應

在豚鼠乳頭狀肌的動作電位穩定后，采用含不同濃度槐果堿的Tyroses液進行灌注。每次灌注持續的時間約8～10 min，同時檢測RP、APA、Vmax及APD。通過加到動作電位不同去極化期額外的上限閾值的刺激來確定有效不應期。當通過槐果堿延長APD及動作電位的有效不應期時，APA出現下降（表1）。為了檢測APD與槐果堿之間的劑量效應，槐果堿的使用濃度范圍為1～100 μmol/L。使APD90延長的EC50為5.93 μmol/L。

2.3 槐果堿對兔竇房結慢反應動作電位的效應

為了明確槐果堿對竇房結的慢反應動作電位，將兔竇房結采用速率為130 次/min的電極刺激進行處理。采用玻璃電極對刺激后的動作電位進行記錄[17]。槐果堿誘導動作電位參數的變化見表2及表3。當采用不同濃度槐果堿處理后，APA及Vmax均出現下降。此外，APD90能夠通過槐果堿進行延長，與快反應動作電位的記錄結果一致。

2.4 槐果堿延長APD的可能機制研究結果

通過chromanol 293B來特異性阻斷Iks，dofetilide阻斷Ikr。在實驗中，先將chromanol 293B用于阻斷Iks，隨后采用不同濃度的槐果堿加入到灌注液中。結果顯示由chromanol 293B誘導的APD延長能夠由槐果堿進一步延長，該結果提示槐果堿能夠通過抑制Ikr來增加APD。為了進一步驗證該結果，本文進一步采用dofetilide來阻斷Ikr，從而實現APD的增加，隨后將不同濃度的槐果堿加入到灌注液中。槐果堿對APD的效應在dofetilide處理的情況下消失。結果提示槐果堿通過阻斷Ikr而非Iks來實現對APD的延長，見圖1。

2.5 槐果堿對心肌細胞INa的調節作用

采用酶分離消化的新生大鼠心室細胞對細胞電流進行記錄，將細胞從控制電位（-110 mV）向靜息電位（-50 mV）進行去極化，時長為300 ms。通過去極化過程誘導較大內向電流，該電流被視作INa[18]。當細胞采用10 μmol/L槐果堿灌注后內向電流減少。結果顯示10 μmol/L槐果堿能夠導致INa下降約18%。

2.6 槐果堿能夠對心肌細胞ICaL的調節作用

通過穿孔鉗采用全部細胞進行記錄。首先將新生大鼠心室細胞在-40 mV條件下將Na+離子通道失活，隨后將細胞去極化到20 mV指令電位，時長為500 ms。由于4-AP用于阻斷Ito，內向電流能夠在指令電位時進行辨識。隨后將10 μmol/L槐果堿加入到灌注液中。3 min后，內向電流出現減少，尾部電流（外向K+電流）也出現消失。相比于對照組，ICaL在20 mV指令電位時，平均減少（33.2±11.7）%。

3 討論

在本研究中，通過研究槐果堿對心臟、心肌細胞及離子通道的效應來明確槐果堿的電生理性質并探索其抗心律失常功能的機制。本文結果顯示異丙腎上腺素（15 μmol）引起的心律失常能夠通過槐果堿（300 μmol）進行逆轉。槐果堿能夠降低4.0%的振幅，24.4%的快速應答動作電位最大去極化動作電流及18.8%的Na離子電流，延長有效不應期為21.1%。

0期快反應動作電位由快速內向Na+電流進行啟動。本文實驗證實槐果堿能夠抑制INa，這就能夠解釋為何槐果堿能夠在快反應動作電位時將APA和Vmax進行降低。在內向外記錄實驗中，K+和Ca2+通道能夠通過CoCl2、TEA、4-AP及CsCl進行阻斷；因此，本實驗中獲得的內向電流為Na+電流。槐果堿處理能夠降低Na+通道電流的開放及大小，該結果提示槐果堿對Na+通道具有抑制效應。

槐果堿能夠在全體細胞水平上降低慢內向電流，即ICaL。慢ICaL能夠啟動慢反應動作電位（包括竇房結中的動作電位）。慢反應動作電位APA及Vmax依賴于Ca2+離子通道的動態變化情況。槐果堿能夠引起APA及Vmax，從而引起槐果堿對Ca2+離子通道的抑制效應。

APD被認為主要與內向ICaL及外向的K+電流相關。本文結果顯示槐果堿能夠在快反應動作電位及慢反應動作電位的情況下延長APD，該結果提示槐果堿能夠抑制外向的K+電流，該電流可能導致APD再次極化及延長。槐果堿介導的K+電流抑制可見于槐果堿介導的K+尾流減少。有必要指出的是，當采用chromanol 293B來阻斷Iks，槐果堿能夠以劑量依賴的方式延長APD；然而，當通過dofetilide阻斷Ikr，槐果堿無法延長APD。雖然該結果并不能排除是否Ikr能夠參與到該過程中，但本研究結果與之前Yang等[19]在其關于槐果堿對表達HERG通道的293細胞的效應一致，其結果證實槐果堿能夠通常影響失活態來抑制HERG通道[19]。

槐果堿對L-型鈣電流具有降低效應，而L-型鈣電流被認為能夠縮短APD90并干擾槐果堿對APD的延長效應[20]，目前的研究認為胞漿鈣離子濃度升高激活能夠促發兩種不同的再次極化電流。IkCa作為其中一種，為鉀離子Kv家族成員；而另一種Ito2則可能為鈣激活氯離子通道。這兩種電流均能夠對胞漿鈣離子濃度升高進行應答，其機制為縮短動作電位時程，限制鈣流進一步流入心臟。基于此，本研究認為槐果堿對IkCa效應較小，其更傾向于延長APD。

本文也存在一些不足之處，槐果堿對異丙腎上腺素引起的心動過速具有明顯的抑制效應，但仍不明確其電生理特性是否在其中發揮作用。異丙腎上腺素誘導的心動過速的機制較為復雜。有關是通過去極化后延遲還是通過再進入機制還是通過改變心律仍不明確，仍需要進一步的研究來證實。

綜上所述，本文結果證實槐果堿能夠逆轉異丙腎上腺素引起的心律失常，其作用機制為抑制Na離子、鈣離子及鉀離子電流。

[參考文獻]

[1] Baumeister P，Quinn TA. Altered calcium handling and ventricular arrhythmias in acute ischemia[J].Clinical Me-dicine Insights Cardiology，2016，10（1）：61-69.

[2] Kang Y，Li Z，He B. An abnormal structure of the left ventricle[J].Heart，2017，doi：10.1136/heartjnl-2017-312068.

[3] Grandi E，Dobrev D. Non-ion channel therapeutics for heart failure and atrial fibrillation：Are CaMKII inhibitors ready for clinical use？[J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology，2017，doi：10.1016/j.yjmcc.2017.10.010.

[4] Calderon JF，Retamal MA. Regulation of connexins expression levels by micrornas，an update[J].Frontiers in Physiology，2016，7：558.

[5] Connolly M，Menown IB，Hussey S，et al.The dronedarone shared-care clinical model and database：A coordinated paradigm to optimize management of evolving clinical recommendations[J].Advances in Therapy，2013，30（6）：623-629.

[6] Rojas-Perez-Ezquerra P，Noguerado-Mellado B，Morales-Cabeza C，et al. Atrial fibrillation in anaphylaxis[J].The American Journal of Medicine，2017，130（9）：1114-1116.

[7] Arispe N，Diaz JC，Simakova O，et al. Heart failure drug digitoxin induces calcium uptake into cells by forming transmembrane calcium channels[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2008，105（7）：2610-2615.

[8] Haiser HJ，Gootenberg DB，Chatman K，et al. Predicting and manipulating cardiac drug inactivation by the human gut bacterium eggerthella lenta[J].Science，2013，341（6143）：295-298.

[9] Trenti A，Zulato E，Pasqualini L，et al. Therapeutic concentrations of digitoxin inhibit endothelial focal adhesion kinase and angiogenesis induced by different growth factors[J].British Journal of Pharmacology，2017，174（18）：3094-3106.

[10] Xu J，Lu XW，Huang Y，et al. Synergism of simvastatin with losartan prevents angiotensin ii-induced cardiomyocyte apoptosis in vitro[J].The Journal of Pharmacy and Pharmacology，2009，61（4）：503-510.

[11] Jin Z，Yang L，Ding G，et al.Sophocarpine against enterovirus 71 in vitro[J].Experimental and Therapeutic Medicine，2017，14（4）：3792-3797.

[12] Zhang Y，Zhan L，Li G，et al. Dimeric Matrine-Type Alkaloids from the Roots of Sophora flavescens and Their Anti-Hepatitis B Virus Activities[J]. Journal of Organic Chemistry，2016，81（15）：6273-6280.

[13] Zhang X，Chen S，Liu J，et al. Protection of cardiomyocytes from coxsackievirus b3 by sophocarpine[J].Chinese Journal of New Drugs and Clinical Remedies，2006，25（9）：709.

[14] Chen S，Chen M，Qian F，et al. A clinical research of sophocarpine in treatment of viral myocarditis[J].Chin J Clin Cardiol，2005，21（10）：608-611.

[15] Baetz D，Regula KM，Ens K，et al. Nuclear factor-kappab-mediated cell survival involves transcriptional silencing of the mitochondrial death gene bnip3 in ventricular myocytes[J].Circulation，2005，112（24）：3777-3785.

[16] Martherus RS，Zeijlemaker VA，Ayoubi TA. Electrical stimulation of primary neonatal rat ventricular cardiomyocytes using pacemakers[J].BioTechniques，2010，48（1）：65-67.

[17] Yang ZF，Wang HW，Zheng YQ，et al. Possible arrhythmiogenic mechanism produced by ibuprofen[J].Acta Pharmacol Sin，2008，29（4）：421-429.

[18] Wang HW，Yang ZF，Zhang Y，et al. Beta-receptor activation increases sodium current in guinea pig heart[J].Acta Pharmacologica Sinica，2009，30（8）：1115-1122.

[19] Yang ZF，Li CZ，Li Q，et al.The sinus node itself also plays a role in heart rate slowing down during postnatal development[J].Sheng Li Xue Bao：Acta Physiologica Sinica，2002，54（4）：282-286.

[20] Katz AM. Physiology of the heart[M].Lippincott Williams & Wilkins，2010.

（收稿日期：2017-10-16）