五株雞滑液囊支原體的分離與鑒定

馬爽 于國營 范根成 郭莉莉 趙鵬 宮曉 宋新宇

摘要：從12份雞滑液囊支原體臨床病料中分離到5株支原體，經(jīng)形態(tài)特性、生化特性、培養(yǎng)特性、分子生物學特性鑒定，5株支原體均為雞滑液囊支原體。活菌計數(shù)結(jié)果表明，HN3株菌液的活菌數(shù)相對較高，為109 CCU/mL；毒力試驗結(jié)果表明，5株雞滑液囊支原體對45日齡SPF雞的發(fā)病率為50%～90%，HN3株毒力相對最高，為90%。

關(guān)鍵詞：雞滑液囊支原體；分離；鑒定

中圖分類號：S852.62 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）14-0099-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.14.023 開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Abstract： Five strains of Mycoplasma synoviae were isolated from twelve suspected samples with clinical symptoms of Mycoplasma synoviae infection.Morphologic observation，biochemical test and molecular biological analysis were used to identify these strains. The results showed that the five strains were all Mycoplasma synoviae. Live bacteria counting results showed that Strain HN3 had highest number of living bacterium，109 CCU/mL. Virulence test results showed that morbidities of five strains to 45 days-old SPF chicken were 50%～90%. Strain HN3 had highest morbidity， was 90%.

Key words： Mycoplasma synoviae； isolation； identification

雞滑液囊支原體病是由雞滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae，MS）引起的雞和火雞的一種急慢性傳染病，不同菌株的致病性有所不同[1]，能夠引起亞臨床型上呼吸道感染[2]以及關(guān)節(jié)炎和傳染性滑膜炎的發(fā)生，導致生長發(fā)育遲緩及胴體降級，甚至會激發(fā)免疫系統(tǒng)的抑制[3]。該病一年四季均可發(fā)生，但以春冬季節(jié)易發(fā)，各種日齡雞只均易感，多見于1～4月齡雞，發(fā)病率一般為5%～15%，死亡率約為1%～10%。雛雞易感性比成年雞要高，抵抗力隨年齡的增長而加強，MS除了水平傳播外，還可以發(fā)生垂直傳播[4]。國內(nèi)外多個地區(qū)均存在MS的感染，并且近年來該病有發(fā)展及蔓延趨勢，給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的經(jīng)濟損失[5]。

本研究從12份臨床病料中進行了病原分離，其中分離到5株支原體，并對這5株支原體進行了鑒定，為下一步研究提供了數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗對象 病料來自吉林、河南、山東、陜西、廣東等地發(fā)病養(yǎng)雞場，采集腫脹跗關(guān)節(jié)、足掌部和龍骨滑液囊囊腫等。45日齡SPF雞購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。

1.1.2 參考菌株 雞滑液囊支原體參考株WVU1853株和雞毒支原體參考株R株均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3 培養(yǎng)基 改良CM液體和改良CM固體培養(yǎng)基均由動物基因工程疫苗國家重點實驗室制備。

1.1.4 引物 根據(jù)GenBank中收錄的雞滑液囊支原體VlhA基因，針對保守區(qū)設(shè)計引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成。雞滑液囊支原體特異性引物：F：5-GCCATTGCTCCTGCTGTTATA-3；R：5-GGGTAGTCCACTCGCATT-3。雞毒支原體特異性引物：F：5-GGATCCCATCTCGACCAGGAGAAAA-3；R：5-CTTTCAATCAGTGAGTAACTGATGA-3。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離 取腫脹跗關(guān)節(jié)、足掌部及龍骨滑液囊內(nèi)容物，接種于改良CM液體培養(yǎng)基，置37 ℃，振蕩培養(yǎng)，待接種后的改良CM液體培養(yǎng)基顏色由猩紅變成橘黃時收獲并傳代，取第2代菌液進行鑒定。

1.2.2 病原菌鑒定

1）形態(tài)觀察。將分離株經(jīng)吉姆薩染色后鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

2）生化特性。將分離株分別進行葡萄糖、麥芽糖、乳糖發(fā)酵試驗及精氨酸分解試驗，細菌L型鑒定，雞紅細胞凝集鑒定試驗[6]。試驗中同時用WVU1853株作對照。

3）培養(yǎng)特性。將分離株分別接種于含輔酶Ⅰ和不含輔酶Ⅰ的改良CM液體培養(yǎng)中，觀察在液體培養(yǎng)基中的生長情況；將分離株分別接種于含有輔酶Ⅰ和不含輔酶Ⅰ的改良CM固體培養(yǎng)基上，置于5%的CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)3～5 d，置低倍鏡下觀察菌落形態(tài)[7]。

4）活菌計數(shù)（CCU/mL）。將分離株菌液分別用改良CM液體培養(yǎng)基以10倍濃度梯度稀釋至10-10，置37 ℃，振搖培養(yǎng)7 d，記錄每管顏色變化（以培養(yǎng)基顏色由猩紅變成橘黃的最終管作為活菌的最高濃度），測定各分離株菌液的活菌數(shù)。

5）分子生物學鑒定。將分離株煮沸制備DNA模板[8]，分別用雞滑液囊支原體特異性PCR引物和雞毒支原體特異性PCR引物進行鑒定。

6）毒力試驗。取分離株原菌液進行攻毒，爪墊注射[9]45日齡SPF雞各10只，每只0.2 mL，觀察14 d內(nèi)攻毒雞發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原分離情況

對12份臨床病料進行了病原分離，從其中5份病料中分離到支原體，分別命名為JL2、HN3、SX1、SD3、GD2。

2.2 形態(tài)特性和生化特性

雞滑液囊支原體分離株（無其他病原污染的5株，下同）經(jīng)吉姆薩染色，形態(tài)均為多形態(tài)的球狀菌。在改良CM液體培養(yǎng)基中，均能發(fā)酵葡萄糖及麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不發(fā)酵乳糖，不能分解精氨酸；細菌L型鑒定均為陰性；均可凝集雞的紅細胞，結(jié)果見表1。

2.3 培養(yǎng)特性

5株分離株在含有輔酶Ⅰ的改良CM液體培養(yǎng)基中均生長良好，培養(yǎng)24～48 h，呈輕度渾濁生長，培養(yǎng)基顏色由猩紅變成橘黃；在含有輔酶Ⅰ的改良CM固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，在低倍鏡下可見圓形、隆起，表面光滑的菌落，典型菌落呈煎蛋狀。5株分離株在不含有輔酶Ⅰ的液體和固體培養(yǎng)基中均不生長。

2.4 活菌計數(shù)

結(jié)果（表2）表明，5株分離菌的活菌數(shù)為107～109 CCU/mL，以HN3株的活菌數(shù)相對最高，為109 CCU/mL。

2.5 分子生物學鑒定

用雞滑液囊支原體特異性引物進行PCR擴增，結(jié)果5株分離株均能擴增出約773 bp的特異性片段，結(jié)果見圖1。用雞毒支原體特異性引物進行PCR擴增，結(jié)果雞毒支原體R株擴增出約732 bp的特異性片段，5株分離株均未擴增出特異性片段，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，5株分離株均為雞滑液囊支原體。

2.6 動物回歸試驗

結(jié)果（表3）表明，5株分離株對45日齡SPF雞均具有不同程度的致病性，發(fā)病率為50%～90%，發(fā)病雞臨床主要表現(xiàn)為攻毒爪不敢著地，趾關(guān)節(jié)腫脹，足掌部腫脹，個別發(fā)病雞跗關(guān)節(jié)腫脹，引起趴臥和跛行。

3 討論

近年來，雞滑液囊支原體在中國廣泛流行，對禽業(yè)養(yǎng)殖帶來很大威脅，造成比較嚴重的經(jīng)濟損失。青島易邦生物工程有限公司對中國6個地區(qū)11個省養(yǎng)殖場的調(diào)查研究[10]發(fā)現(xiàn)，該病在中國6個地區(qū)11個省份均有發(fā)生，雞滑液囊支原體感染雞群多見于1～4月齡，平均發(fā)病日齡為62日齡；發(fā)病率為5.75%～25.77%，6個品種雞（海蘭褐、海蘭白、羅曼、白羽肉種雞、AA肉種雞及三黃雞）的平均發(fā)病率為13.92%；死亡率為4.09%～15.68%，平均死亡率為9.79%；發(fā)病率和死亡率均存在地區(qū)差異。血清學檢測結(jié)果表明，血清陽性率為30.23%～54.67%。雞滑液囊支原體的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，表明該病在中國雞群中有發(fā)展及蔓延的趨勢，應引起養(yǎng)殖界和研究者的高度關(guān)注。

參與文獻：

[1] 曹中贊，欒新紅，劉勝旺，等.禽滑液囊支原體研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2012，33（11）：113-117.

[2] OLSON N O，ADLER H E，DAMASSA A J，et al. The effect of intranasal exposure to Mycoplasma synoviae and infectious bronchitis on development of lesions and agglutinins[J].Avian Dis，1964，8（4）：623-631.

[3] LANDMAN W J，F(xiàn)EBERWEE A. Longitudinal field study on the occurrence of Mycoplasma synoviae in Dutch turkey flocks with lameness and experimental induction of the condition[J]. Avian Pathol，2012，41（2）：141-149.

[4] 宋戰(zhàn)勝.雞滑液囊支原體病發(fā)病情況調(diào)查及診治[J].中國家禽，2009，31（12）：51-52.

[5] BLANCHARD H，BROWNING G. Mycoplasma：Moleoularbiology，Pathogencity and Strategies for Control[M].Boca Raton：CRC Press，2005.

[6] 郭建華，陳德威，霍乃蕊，等.雞滑液囊支原體的分離與鑒定[J].中國家禽，1998，20（6）：21-22.

[7] 丁美娟，張小飛，尹秀鳳，等.雞滑液囊支原體的分離和鑒定研究[J].中國家禽，2012，33（24）：27-29.

[8] 李桂喜，閆愛萍，王珍珍，等.雞滑液囊霉形體的流行病學調(diào)查及其防治[J].中國動物傳染病學報，2013，21（5）：45-50.

[9] 李桂喜，周勇岐，盧衛(wèi)東，等.一株雞滑液囊支原體的分離與鑒定[J].獸醫(yī)導刑，2012（1）：71-72.

[10] 馬 爽，郭莉莉，宋新宇，等.雞滑液囊支原體感染的流行病學調(diào)查與分析[J].中國家禽，2016，38（23）：68-71.