魔芋膳食纖維固體飲料中優勢菌的分離、初步鑒定及菌相分析

劉健 秦磊磊 李素媛 周陶鴻 江一飛 黃龍 羅愛玲

摘要：對魔芋膳食纖維固體飲料中的微生物進行分離及初步鑒定，同時對飲料生產環境背景菌進行調查，以此確定魔芋膳食纖維固體飲料中的優勢菌，并對菌相成因進行分析。結果表明，6個批次樣品共分離得到32株菌，其中革蘭氏陽性芽孢短桿菌27株，革蘭氏陽性芽孢長桿菌2株，革蘭氏陰性長桿菌1株，霉菌2株。6個批次樣品均未分離得到腸桿菌、葡萄球菌及乳酸菌。背景菌調查發現，飲料生產環境空氣中共分離得到200株菌，其中103株為芽孢桿菌。從干燥車間接觸表面分離得到9株菌，全部為芽孢桿菌。表明芽孢菌為魔芋膳食纖維固體飲料產品菌相優勢菌，與其生產工藝及生產環境存在一定的關聯性。

關鍵詞：魔芋膳食纖維固體飲料； 菌相； 優勢菌； 背景菌

中圖分類號：TS207.4 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）14-0060-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.14.014 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： To ascertain dominant microorganisms in konjac dietary fiber solid drinks，and analysis the reason for the bacteria existence，the bacteria in the product as well as in the production environment were isolated and identified. The results showed that 32 strains of bacteria were found in six batches of samples，including 27 strains gram positive bacillus，2 strains of gram positive long coli bacillus，2 strains of moulds，1 strain of gram-negative bacillus，no enterobacteriaceae，lactic acid bacteria and staphylococcus. Through the investigation of background bacteria in the production environment，200 strains of microorganisms were isolated from the atmosphere， including 103 strains bacillus. Among them，9 bacillus were isolated from the contact surface of drying workshop. Results indicated that bacillus was the dominant microorganisms of konjac dietary fiber solid drinks. There is a certain correlation with the production process and the production environment.

Key words： konjac dietary fiber solid drinks； microflora； dominant bacteria； background bacteria

魔芋膳食纖維是目前發現的最優良可溶性膳食纖維之一， 具有多種良好的食品學特性，其保健功能也日益受到人們的重視，目前已廣泛應用于食品、保健品、醫藥、化妝品、化工等領域[1]。目前，魔芋制品的質量安全問題關注點集中在魔芋制品生產過程中二氧化硫、生物堿、重金屬及農藥殘留問題，但關于魔芋制品微生物指標檢驗檢測方法的研究卻寥寥無幾。魔芋膳食纖維固體因其特殊的飲用方法，其產品衛生狀況值得高度關注，產品中的微生物種類及數量是評價產品衛生狀況的重要依據。

魔芋膳食纖維具有非常強的吸水性，對其產品微生物指標按照國家標準進行檢測時樣品迅速吸水膨脹，流動性極差，容易帶來微生物無法均勻分布的問題，無法準確定量定性，給企業自檢及監管檢測帶來困難。

本試驗對魔芋膳食纖維固體飲料產品中的微生物及生產環境中背景菌進行分離和初步鑒定，研究魔芋膳食纖維中的優勢微生物及其與生產環境的關系，旨在為魔芋膳食纖維固體飲料生產環節的自檢和政府監督檢測其衛生指標時篩選適用稀釋液提供理論基礎，進而指導企業生產控制。

1 材料與方法

1.1 材料

魔芋膳食纖維固體飲料及該固體飲料廠家生產環境。

營養瓊脂培養基、葡萄糖發酵培養基、MRS培養基、VRBGA培養基、Baird-parker培養基、半固體培養基、7%氯化鈉胰胨水、氧化酶試紙、過氧化氫、GN鑒定卡、GP鑒定卡、BCL鑒定卡、革蘭氏染色液、芽孢染色液。

試驗設備主要有生化培養箱、電熱恒溫鼓風干燥箱、滅菌鍋、生物安全柜、顯微鏡、生化鑒定儀VITEK2-compact。

1.2 方法

1.2.1 產品中微生物的分離 在潔凈室稱取0.1 g樣品于無菌平皿中，每個樣品3次重復，分別傾注營養瓊脂、MRS、VRBGA、PDA、Baird-parker培養基，混勻，待瓊脂凝固后于生化培養箱中培養[2]，培養條件見表1。

1.2.2 生產環境中背景菌采集

1）空氣采樣。取樣方法參照GB/T 16293-2010[3]、GB/T 16294-2010[4]的測試方法，采集動態環境空氣中的微生物，將采集的微生物置于36 ℃培養48 h。

2）接觸面采樣。取樣方法參照文獻[5]，采集生產設備、器具接觸面的微生物，每個設備器具選取5個采樣點。將采集的微生物置于36 ℃培養48 h。

3）工人手采樣。取樣方法參照文獻[5]，每個工序選取1名工人，將采集的微生物置于36 ℃培養48 h。

1.2.3 微生物的分離及初步鑒定 從瓊脂培養基上挑取菌落，在營養瓊脂培養基和血平板上進行平板劃線分離以得到純化的單菌落，觀察其菌落特征[6]。進行革蘭氏染色及芽孢染色，觀察其個體形態特征，并進行相應的生理生化試驗（氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗、葡萄糖發酵試驗、動力試驗、嗜鹽試驗）[7，8]，利用生化鑒定儀鑒定到科和屬。

2 結果與分析

2.1 產品菌相的初步分離及鑒定

如表2、表3所示，通過分離和初步鑒定，6個批次樣品共分離32個菌落，其中革蘭氏陽性芽孢短桿菌27株，1株不溶血，菌落形態存在一定的差異，菌體大小存在一定差別，芽孢形成位置為中生；革蘭氏陽性芽孢長桿菌2株，其中1株不溶血，菌落形態存在差異，芽孢為中生。革蘭氏陰性長桿菌1株，不溶血，經VITEK鑒定為泛菌屬（圖1、圖2）；霉菌2株。6個批次樣品均未分離到腸桿菌、葡萄球菌及乳酸菌。

2.2 生產環境背景菌分析

2.2.1 空氣背景菌 通過測定洗粉車間、真空干燥間及內包間空氣中浮游菌及沉降菌，共采集到200株菌，通過菌落形態及芽孢染色，初步判斷其中芽孢菌103株，生產環境空氣中存在較大數量的芽孢菌，各車間背景菌情況見圖3。內包間為潔凈廠房，魔芋精粉半成品在內包間內進行分裝，內包間共采集到16株菌，其中芽孢菌10株，經洗粉及干燥后，內包車間空氣中浮游菌、沉降菌數量及其中芽孢數量均有比較明顯的減少，但芽孢菌屬仍為主要背景菌。

2.2.2 接觸面背景菌 對洗粉車間投料口及出料口，真空干燥車間轉用車、閃蒸車間入料口及出料口、內包間投料口及卷膜軸表面微生物進行采集，在真空干燥車間轉用車表面、閃蒸車間入料口、閃蒸車間出料口分別采集到3、2、4 CFU/g，均為芽孢菌（表4）。

2.2.3 工人手背景菌 在內包間工人雙手表面未采集到菌株，工人手經過嚴格清洗消毒后對產品菌相構成影響較小。

2.2.4 各工序產品衛生狀況 分別采集洗粉、真空干燥、閃蒸工序產品及原料進行菌落總數測定（表5），洗粉及真空干燥工序產品菌落總數分別為20、10 CFU/g，閃蒸工序產品菌落總數為40 CFU/g，均為芽孢菌，原料魔芋微粉菌落總數為3 700 CFU/g，所得菌株多數為芽孢菌。

通過對生產車間、接觸面及各工序樣品背景菌調查，空氣中芽孢菌數量占總分離菌株的51.5%，原料魔芋微粉中芽孢菌數量占菌落總數的81.1%，接觸面及各工序樣品中所分離菌株均為芽孢菌，初步推斷芽孢菌屬為生產環境背景優勢菌。

2.3 產品菌相與生產環境背景菌規律

原料中存在大量的芽孢菌，這可能與魔芋生長土壤環境及魔芋微粉生產工藝及環境有較大關系，前期工序粉塵較大，原料中潛在的芽孢菌可能對生產環境空氣存在較大影響。

根據表5可知，經過長時間的乙醇洗粉及真空干燥，基本能夠滅活原料中的微生物，僅少量耐受性較強的芽孢菌仍可存活，洗粉及真空干燥均在密閉管道中進行，空氣中芽孢菌對前期工序產品菌相構成影響不大。

閃蒸工序樣品中芽孢菌數量有一定的增加，閃蒸車間投料口與真空干燥間未完全隔斷，在真空干燥間轉用車、閃蒸車間入料口及出料口均采集到一定數量的芽孢菌，空氣環境、轉用過程、閃蒸管道衛生這些因素均有可能造成真空干燥工序產品一定程度的二次污染，閃蒸工序采用氣流干燥，干燥溫度較低，僅為50 ℃左右，可能對管道及半成品中潛在的芽孢菌滅活能力減弱，從而造成該工序末端產品中含有芽孢菌。內包間為潔凈車間，其空氣中存在一定數量的芽孢菌，來源可能是半成品粉塵。芽孢菌在空氣中較難清除，可長期存在，可能給環境及產品帶來持續污染?？諝猸h境、接觸面、半成品及終產品中的優勢菌具有一致性，原料微粉、空氣環境及閃蒸管道可能為芽孢菌的主要來源。

3 小結與討論

從魔芋膳食纖維固體飲料產品中分離得到32株菌，其中29株屬于芽孢菌屬，芽孢菌屬為魔芋膳食纖維固體飲料菌相優勢菌。從生產環境中亦分離到大量的芽孢菌，魔芋膳食纖維生產工藝中需用乙醇對魔芋精粉進行純化，乙醇可使細菌蛋白凝固從而對大多數細菌具有較強的殺滅作用，同時生產工藝中涉及高溫真空干燥過程，可殺滅大多數細菌，但部分芽孢可耐受高溫不被殺死。因此，本試驗得出的宜昌地區魔芋膳食纖維固體飲料產品菌相構成主要為芽孢菌屬，與產品生產工藝及環境有一定的關聯性。

由于魔芋膳食纖維固體飲料生產過程中經過洗粉、高溫真空干燥等工藝，菌落總數會大大降低。但芽孢菌屬對惡劣環境具有較強的抗性，芽孢可在環境中長期存活[9]，較難清除，部分條件致病芽孢菌數量達到一定限值后會對人體造成一定損害，本試驗排除所用材料中存在蠟樣芽孢的可能，但空氣及管道中芽孢菌的長期積累依然可能造成產品衛生指標不合格，企業應加強對芽孢菌的控制，由于粉塵及空氣可能為污染的主要來源，建議企業各工序之間采取全封閉管道生產，可有效降低產品污染。

本試驗從產品中所分離菌株未能鑒定到種，需進一步進行鑒定，確認其危害性，同時需采取其他技術手段[10，11]分析加工過程中各環節的微生物種群多樣性，比較各環節菌群的差異，對比各環節分離菌株的一致性，進一步確認產品芽孢菌污染主要來源，以便更好地指導企業對環境及工藝進行改造。

參考文獻：

[1] 鐘 燕，索化夷.魔芋葡甘聚糖的功能及在食品領域的應用[J].中國釀造，2014，33（8）：6-9.

[2] 廖 鑫.巴氏鮮奶中優勢腐敗微生物的菌相分析與生長預測模型的研究[D].武漢：武漢工業學院，2011.

[3] GB/T 16293-2010，醫藥工業潔凈室（區）浮游菌的測試方法[S].

[4] GB/T 16294-2010，醫藥工業潔凈室（區）沉降菌的測試方法[S].

[5] GB 15982-2012，醫院消毒衛生標準+WS367-2012醫療機構消毒技術規范[S].

[6] 孫承鋒，南慶賢，牛天貴.醬牛肉中腐敗細菌的分離與鑒定[J].中國食品學報，2001，1（1）：56-60.

[7] 劉勤華，黃 明，潘潤淑，等.真空包裝醬牛肉中腐敗細菌的分離、初步鑒定與菌相變化分析[J].食品科學，2009，30（23）：297-300.

[8] 傅 鵬，李平蘭.冷卻豬肉初始菌相分析與冷藏過程中的菌相變化規律研究[J].食品科學，2006，27（11）：119-124.

[9] 李興佳，王玉英，柴艷兵，等.嬰幼兒配方奶粉中的菌相分析[J].食品科技，2015，40（9）：289-293.

[10] 董 洋.真空包裝鹽水鵝菌相變化規律及貨架期預測研究[D].南京：南京農業大學，2011.

[11] 馬含笑，李 春，周曉宏，等.真空包裝醬豬肝中污染微生物的分離鑒定和抑菌研究[J].食品研究與開發，2012，33（8）：204-210.