刺桐葉過氧化物酶對水體中聯苯胺的降解

王雨雪 劉夢齡 王辛 肖強

摘要：探討刺桐（Erythrina variegata Linn.）葉片過氧化物酶在清除水體中EDCs的應用前景，對刺桐葉過氧化物酶與H2O2形成的催化體系降解聯苯胺的效果和反應條件進行研究。結果表明，刺桐過氧化物酶生物催化體系對聯苯胺有良好的降解效果。在溫度25～45 ℃，pH 7～8，H2O2與聯苯胺物質的量濃度比為3.0～5.0條件下，10 U/mL刺桐過氧化物酶濃度對200 μmol/L聯苯胺的3 h降解率達100%，效果最佳。

關鍵詞：刺桐（Erythrina variegata Linn.）；過氧化物酶；聯苯胺；降解

中圖分類號：Q55 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）14-0042-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.14.009 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： In order to develop economic value of the leaves，investigated the application prospect of the peroxidase in the Erythrina variegatas leaves in the removal of EDCs in water. The effect and best reaction conditions for the degradation of benzidine by E. variegata peroxidase-H2O2 were studied. The results showed that the E. variegata peroxidase-H2O2 had degradation effects on benzidine. Respectively，suitable reaction conditions： Temperature of 25～45 ℃， pH 7～8，H2O2/BZ=3.0～5.0（benzidine and hydrogen peroxide molar ratio），when the concentration of peroxidase was 10 U/mL，the best scavenging rate to benzidine （200 μmol/L） was 100%.

Key words： Erythrina variegata Linn.； peroxidase； benzidine； degradation

聯苯胺類化合物被廣泛用于印染、紡織、皮革等行業。該類化合物具有較高的毒性，在芳胺化合物中，聯苯胺（Benzidine，BZ）的致癌性僅次于2-萘胺[1]，長期接觸聯苯胺可增加罹患肺癌的風險[2]，尤其是職業接觸[3]。目前聯苯胺廢水的處理方法有電解法、化學催化氧化法、微生物降解法、光催化法。電極催化法耗電量大、工序復雜[4]、經濟效益低。利用熱活化過硫酸鹽可以降解廢水中的聯苯胺[5]。微生物降解法綠色無污染[6]，但周期長，在惡劣的污水環境中微生物生存能力會受到限制。光電催化法多利用光催化劑催化降解聯苯胺[7]，高效廉價，但降解率較低。過氧化物酶催化降解聯苯胺法是近年來新興的酚污染降解法，以其微量、高效、綠色經濟的特點受到關注。

過氧化物酶（Peroxidase，POD）是一種以過氧化氫為電子受體[8]，通過催化底物發生氧化反應改變結構，引起底物理化性質發生變化的生物催化劑。它廣泛分布于動植物和微生物體內，在細胞中發揮催化降解過氧化氫作用。過氧化物酶催化活性在工業上也用于石化、造紙、紡織等行業廢水中酚類和芳香胺類污染物高效降解[9]。國內外許多學者開展了過氧化物酶用于醫療診斷、廢物脫色、胺類、酚類物質降解的條件優化、動力學特性和反應機理研究[10]，最早采用過氧化物酶降解廢水中的酚類和芳香胺類化合物，并將其用于含酚廢水的脫色，該過氧化物酶對底物的氧化是高度非特異的[11]，這使得利用過氧化物酶結合過氧化氫催化氧化降解聯苯胺成為可能[12]。

刺桐（Erythrina variegata Linn.），多年生落葉喬木，具有獨特的觀賞價值，在中國華南地區園林中被廣泛應用[13]。在其生長過程中，大量的刺桐葉片凋落，刺桐葉過氧化物酶具有較高活性、穩定性較好。本研究通過提取刺桐中的過氧化物酶，構建過氧化物酶-H2O2生物催化體系，利用控制單因素變量法研究刺桐過氧化物酶催化降解水環境中聯苯胺的最佳反應條件，單因素變量包括過氧化物酶酶量、溫度、pH、H2O2與聯苯胺物質的量濃度比等。旨在充分利用刺桐，提高其經濟價值，探索一種高效、經濟、清潔的聯苯胺污染處理方法的工藝條件，以期為生物催化氧化法降解工業廢水中聯苯胺類提供理論和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以湖北民族學院植物園內種植的10年生刺桐（經湖北民族學院林學園藝學院易詠梅教授鑒定）成熟葉為原料。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液制備 采摘成熟無病蟲害刺桐樹葉，去除主脈，剪碎，稱取50 g，自來水洗凈后，用去離子水沖洗，再用吸水紙吸干表面水分。分次加入250 mL預凍的含5% PVP-K30（聚乙烯吡咯烷酮-K30）和2 mmol/L EDTA（乙二胺四乙酸）的冰水混合磷酸緩沖液（50 mmol/L，pH 7.8）勻漿，4 ℃下5 000 r/min離心，上清液即為粗酶液，置于4 ℃保存。

1.2.2 酶活的測定 參考Amako等[14]的方法并稍做改進。

1）反應混合液配制。取50 mL磷酸緩沖液于燒杯中，加入28 μL愈創木酚于恒溫式磁力攪拌器上加熱攪拌，直至完全溶解。待溶液冷卻后加入19 μL 30% H2O2溶液，攪拌混勻后置于4 ℃低溫保存。

2）酶活性測定。反應體系共4.0 mL（1.9 mL 100 mmol/L的磷酸-檸檬酸緩沖液，pH 6.0，含1 mL 40 mmol/L愈創木酚和1 mL 40 mmol/L H2O2，0.1 mL酶液），于波長470 nm，30 ℃下記錄OD變化。1個酶單位定義為測定條件下每分鐘OD470 nm變化0.1所需的酶量。

1.2.3 酶活力計算 以每分鐘OD變化（升高）0.1個酶活性單位（U），按下式計算活性[15]。

其中，ΔA470 nm指反應時間內吸光度的變化；W指取酶液總蛋白質質量（g）；t指反應時間（min）；Vt指取酶液總體積（mL）；Vs指測定時取用酶液體積（mL）。

1.2.4 聯苯胺降解條件 研究最佳酶濃度時，在0.05 mol/L pH為7的磷酸-檸檬酸緩沖液中，含200 μmol/L聯苯胺（后續試驗均使用此濃度）、200 μmol/L過氧化氫，反應溫度25 ℃（在集熱式恒溫加熱磁力攪拌器上操作），設置酶濃度分別為2、5、10 U/mL，之后對其他降解條件的研究除變量外均采用此條件。研究最佳溫度時，設置的反應溫度分別為25、30、35、40、45、50 ℃。研究最佳pH時，采用0.05 mol/L緩沖液體系，pH 3～5采用乙酸緩沖液，pH 7～8采用磷酸鹽緩沖體系，pH 9采用硼酸鹽緩沖液。研究最佳H2O2與聯苯胺物質的量濃度比時，按照H2O2與聯苯胺物質的量濃度比為0.2、0.5、0.8、1.2、2.0、3.0、5.0加入物質的量溶液。反應混合物置于恒溫水浴鍋中攪拌，加入物質的量溶液啟動反應，反應體系共20 mL。于反應0（未加物質的量時）、1、3、5、15、45、90、120、180 min取1 mL反應溶液，加入2 mL甲醇終止反應，即實現刺桐葉片過氧化物酶對聯苯胺的降解。在終止反應液里加入適量明礬，搖勻，過夜沉淀后，5 000 r/min離心10 min。上清液過0.22 μm濾膜后檢測聯苯胺含量。

1.3 分析方法

1.3.1 色譜分析條件 聯苯胺濃度采用高效液相色譜-飛行時間質譜法[16]測定，采用Agilent公司ZORBAX C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）色譜柱。流動相為50%甲醇-水溶液，柱溫30 ℃，體積流量0.2 mL/min。

1.3.2 質譜分析條件 ESI離子源負模式，干燥氣溫度350 ℃，流速10 L/min；霧化器壓力45 psig，毛細管電壓3 500 V，毛細管出口電壓150 V，錐孔電壓65 V，采集速度1.5 spectra/s，選擇離子（ESI）采集方式，選定的分子離子[M-H]-的質荷比為184.2（聯苯胺）。

2 結果與分析

2.1 最佳降解酶濃度確定

在pH 7的磷酸緩沖液中，含200 μmol/L聯苯胺，400 μmol/L H2O2，反應溫度25 ℃，改變酶濃度（2～10 U/mL），考察不同酶濃度對降解聯苯胺的影響，結果見圖 1。從圖1可以看出，隨著反應體系酶濃度的升高，聯苯胺最終剩余率不斷下降，當酶濃度達到10 U/mL時，3 h后可以完全降解聯苯胺，低于此濃度則不能完全降解，這主要由于酶濃度較低時單位體積反應溶液中無法提供一定數量的活性中心，造成聯苯胺降解率降低。

2.2 最佳降解pH的確定

在緩沖液中，含200 μmol/L聯苯胺，400 μmol/L H2O2，10 U/mL過氧化物酶，溫度為25 ℃，用醋酸-醋酸鈉、磷酸-檸檬酸、硼砂緩沖液控制反應體系pH（3～9），考察不同pH對刺桐葉片過氧化物酶降解聯苯胺的影響，結果見圖 2。從圖2可以看出，在pH為8時，催化反應經過90 min對聯苯胺的降解率達到100%，pH為7時，3 h后對聯苯胺的降解率也能達到100%。在pH 3～8時，聯苯胺降解率有隨著pH的升高逐漸升高的趨勢，在pH 9條件下，聯苯胺不能被完全降解。

2.3 最佳降解溫度的確定

在pH 7的磷酸緩沖液中，含200 μmol/L聯苯胺，400 μmol/L H2O2，10 U/mL過氧化物酶，改變溫度（25～50 ℃），考察不同溫度對刺桐葉片過氧化物酶降解聯苯胺的影響，結果見圖 3。從圖3可以看出，在溫度為25～45 ℃時，3 h后反應體系中的聯苯胺均能被完全降解，且趨勢表現為隨著溫度的升高催化反應速率逐漸減慢，在溫度為25 ℃條件下，催化反應經過90 min即可完全降解聯苯胺，溫度為50 ℃條件下，3 h后聯苯胺的降解率只有70%左右。

2.4 最佳降解H2O2濃度的確定

在pH 7的磷酸緩沖液中，含200 μmol/L聯苯胺，400 U/mL過氧化物酶，溫度為25 ℃，按照H2O2與聯苯胺物質的量濃度比為0.2～5.0加入H2O2溶液，考察H2O2與聯苯胺不同摩爾比對刺桐葉片過氧化物酶降解聯苯胺的影響，結果見圖4。從圖4可以看出，當H2O2與聯苯胺物質的量濃度比為3.0～5.0時均能達到100%的降解率。H2O2與聯苯胺物質的量濃度比在3.0～5.0以下時，3 h后聯苯胺的降解率和降解反應速率隨著物質的量濃度比的增大而增大。綜合上述分析，刺桐過氧化物酶-H2O2催化降解聯苯胺反應體系優化H2O2與聯苯胺物質的量濃度比為3.0～5.0。

3 小結與討論

植物過氧化物酶催化降解酚類有機物的實質是氧化耦合反應，能使帶有酚或者苯胺官能團的化合物被氧化形成自由基或醌中間體，再通過共價鍵相互聚合，形成無定形的化合物[17，18]。目前關于不同植物過氧化物酶降解酚類有機污染物已有許多報道。林玲云[19]利用辣根過氧化物酶（HRP）催化氧化苯胺中間體乙醇胺（Monoethanolamine，MEA）的降解率可達到99%；Kurnik等[20]利用馬鈴薯過氧化物酶降解2，4-二氯苯酚的降解率達95%～98%；Ahmedi等[21]研究結果顯示，過氧化物酶對剛果紅（Congo red，CR）的催化降解率可達95%左右。以上結論均與本研究的最終降解率相接近。本研究中催化降解聯苯胺的酶濃度試驗的結果表明，在10 U/mL的酶濃度下，刺桐葉過氧化物酶對水環境中200 μmol/L聯苯胺的3 h降解率可以達到100%，且反應后的溶液中剩余酶活并未出現明顯下降，仍有利用價值。

不同植物來源過氧化物酶的性質以及降解的對象不同導致降解反應的最佳條件也不同。洪健等[22]研究發現，在15～80 ℃，厚樸過氧化物酶活性隨著溫度的升高而升高，熱穩定性較好，具有較寬的溫度適應范圍。Kurnik等[23]發現，在10～60 ℃，馬鈴薯過氧化物酶對苯酚的降解率達97%。本研究中，刺桐過氧化物酶在25～45 ℃，可以保持催化降解聯苯胺的良好效果，即該酶能夠保持較好的溫度適宜性。在溫度為50 ℃時，該酶對聯苯胺的催化降解率顯著下降，說明該催化反應受溫度影響較大，該酶耐高溫性能較差。這可能是因為高溫導致了酶的構象發生改變，對酚類化合物的降解率也不穩定。而此反應在室溫下進行即可達到良好的效果，無需特別控制反應溫度，這對其在工廠化應用方面很有利。

有研究顯示，過氧化物酶在一個較寬的pH范圍內都能保持較好的處理效果[24]，羅思強[25]研究過氧化物酶降解NP的pH優化試驗表明，過高或過低的pH都會導致酶的催化效率降低；聶艷艷等[26]研究表明，氯過氧化物酶催化降解鄰苯二胺的最佳pH為5，本研究中刺桐過氧化物酶降解聯苯胺的最佳pH為7、8，對聯苯胺的最終降解率均能達到100%，表明不同來源的過氧化物酶發揮作用的最佳pH不同。另一方面，在pH 3～7，pH越大，催化降解聯苯胺的反應越迅速，降解率越高，這可能是由于pH的降低影響了底物和酶的解離程度，導致催化中間體的形成受阻，從而降低酶的活性，減慢了催化反應的速率。當pH為9時，聯苯胺也不能被完全降解，這可能是由于溶液中的OH-逐漸增加會抑制H2O2分解過程中·OH的產生[27]，降低了氧化劑的濃度，減慢了催化反應速率并影響聯苯胺的最終降解率。

趙廣華等[28]研究不同濃度的H2O2催化降解雙酚A試驗結果表明，催化反應體系中H2O2與雙酚A最適物質的量濃度比為5，在50 min內可以完全清除。在本研究中，刺桐葉過氧化物酶反應體系中H2O2與聯苯胺物質的量濃度比為3.0～5.0時，可以完全清除，二者結果相近，其酶促降解反應的作用趨勢是當聯苯胺與H2O2摩爾比低于最適摩爾比時，酶對聯苯胺的催化降解率隨聯苯胺與H2O2摩爾比增加而增加，當聯苯胺與H2O2摩爾比高于最適摩爾比時，酶對聯苯胺的催化降解率隨聯苯胺與H2O2摩爾比增加而降低。這可能是由過量的H2O2與有活性的酶中間物反應形成失活態造成的，類似于辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）失活機理[29]。

綜上所述，從刺桐葉片中提取到活性較高的過氧化物酶，該酶在pH 7～8，溫度25～45 ℃，H2O2與聯苯胺物質的量濃度比為3.0～5.0條件下，對聯苯胺降解率可達100%，顯示了刺桐葉過氧化物酶應用于酚類污染治理的潛力。

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