甘草顏色與HPLC指紋圖譜信息相關性研究＊

陳慧榮，林相龍，楊瑞琦，曹光昭，閆永紅＊＊，鄒慧琴＊＊

（1.北京中醫藥大學中藥學院 北京 102488；2.北京寶德潤生醫藥科技發展有限公司 北京 100088）

傳統性狀鑒別是中藥飲片質量評價的有效方法，其中顏色是質量評價的重要指標之一，與其品質密切相關。如甘草自古以來以外皮紅棕色、斷面黃白色為佳，《本草經集注》稱“赤皮斷理，看之堅實者……最佳”[1]，《新編中藥志》載“皮細緊、色紅棕、斷面黃白色、粉性足者為佳”[2]。顏色對甘草質量的鑒別至關重要。然而，傳統性狀鑒定法的感官顏色存在主觀性強、描述模糊等局限性，缺乏客觀標準。

色度學是研究人的顏色視覺規律、顏色測量的理論和技術的一門學科，在中藥領域的運用能使中藥顏色描述實現客觀化、規范化。國際發光照明委員會（CIE）色度學系統以3色原理為基礎，即任何一個顏色，都能用線性無關的3個原色適當的相加混合與之匹配。三原色可任意選定，但其中的任何一種原色均不可由其他兩種原色相加混合得到。與待測顏色達到匹配時所需要的三原色的數量，稱為三刺激值。本實驗采用的是目前應用較為廣泛的CIE1976L*a*b均色空間系統[3-5]，其中，明度L*、色度a*和b*三個坐標軸互相垂直。L*表示明度，明度越大，越偏白；明度越小，越偏黑；a*和b*表示不同的色調方向，+a*表示紅方向，-a*表示綠方向；+b*表示黃方向，-b*表示藍方向。

課題組前期研究，摸索并建立了甘草表面、斷面顏色數字化的測量方法[6]，本研究在此基礎上，采用色度學技術將甘草顏色客觀化，并對其進行HPLC指紋圖譜分析，探索整體化學成分質量與顏色的相關性。為將色度測定方法推廣應用于其他藥材的顏色測量提供理論依據，完善中藥性狀鑒別，推動傳統學科發展創新。

1 實驗材料

1.1 樣品

收集來自甘肅西部地區、內蒙古杭錦旗、通遼、赤峰地區野生及栽培甘草樣品共34份，所有樣品經北京中醫藥大學中藥資源與鑒定系閆永紅教授鑒定，確定為甘草（烏拉爾甘草）Glycyrrhiza uralensis Fisch.，樣品編號見表1。

1.2 儀器

ZN-02小型粉碎機（北京興時利和科技發展有限公司）；U-3010紫外可見分光光度計（日本日立公司）；Agilent 1100型高效液相色譜儀，四元泵，DAD檢測器，自動進樣器，柱溫箱，Agilent 1100色譜工作站；DIKMA Platisil ODS色譜柱（5 μm，250×4.6 mm）；0.45 μm針筒式微孔濾膜過濾器；BP211D型1/100000電子分析天平（德國賽多利斯）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）。

表1 收集的野生及栽培甘草樣品基本信息

1.3 試劑

乙腈為色譜純（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；甲醇、磷酸等為分析純（北京化工廠）；水為屈臣氏純凈水；甘草酸銨標準品（供含量測定用，甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207，中國食品藥品檢定研究院，生產批號110731-200615）、甘草苷標準品（供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院，生產批號111610-201005）。

2 實驗方法

2.1 甘草斷面顏色測量方法[7]

2.1.1 樣品制備

將甘草切成長約2 cm的小段，對甘草段施以壓力，令表皮脫落，將去皮的甘草段打粉，過3號篩，粉末置于自制玻璃測色皿中，蓋上石英鏡片，以測色皿中粉末不隨意晃動為準。

2.1.2 顏色測定條件

采用日立3010紫外可見分光光度計進行測量，測量起止波長：380-780 nm；狹縫寬度：1 nm；照明光源：D65；視場選擇：10度視角；掃描速度：600 nm·min-1。

2.1.3 精密度考察

取杭錦旗野生樣品，按上述供試品制備方法制備供試品，連續測量5次。測量結果RSD均小于3%，結果間ΔE*ab均小于1，ΔE*ab平均值=0.09，色差低于人眼可變范圍。表明結果穩定。

2.1.4 重復性考察

隨機取杭錦旗野生樣品5份，按上述供試品制備方法制備供試品，分別進行測量。測量結果顯示RSD均小于3%，結果間ΔE*ab均小于1，ΔE*ab平均值=0.52，色差低于人眼可變辨范圍。表明結果穩定。

2.2 HPLC指紋圖譜方法的建立[8]

2.2.1 標準溶液的制備

精密稱取甘草酸銨及甘草苷對照品，加入提取液（甲醇：5%氨水=80∶20），制成每1 mL含甘草酸0.2 mg、甘草苷0.2 mg的對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

將各甘草樣品粉碎，過3號篩。精密稱取0.1g于25 mL量瓶中，加入約25 mL提取液（甲醇：5%氨水＝80∶20），冷浸24 h。超聲提取30 min（功率50 kw），放冷至室溫，加提取液至刻度，搖勻后過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液，備用。

2.2.3 色譜條件

流動相A：0.1%磷酸水（每500 mL含7滴THF），流動相B：乙腈。梯度洗脫條件及檢測波長見表2。流速為0.8 mL·min-1，進樣量為15 μL，柱溫24℃，檢測時間為50 min。

按照按上述確定的供試品、對照品制備方法及測試條件進行樣品分析（圖1、2、3）。

2.2.4 精密度考察

取甘草酸含量相對較高的杭錦旗野生甘草樣品為供試品。按供試品制備方法制備1份，以上述選定方法連續進樣5次，考察方法精密度（圖4）。

比較共有峰中，單峰面積大于5%總峰面積、分離效果較好的三個色譜峰的保留時間、峰面積，并計算相對標準偏差，色譜峰保留時間的RSD為0.05-0.08%，峰面積的RSD為0.14-0.51%。樣品圖譜經國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統進行自動匹配，不經多點校正，相似度在0.998-1.000之間（不包括自身比較），該方法精密度良好。

2.2.5 重現性考察

取杭錦旗野生甘草樣品5份，按供試品制備方法提取，以上述選定方法依次進樣各一次，扣除稱樣量差別（稱樣量盡量接近），考察方法重現性。比較共有峰中，單峰面積大于5%總峰面積、分離效果較好的三個色譜峰保留時間、峰面積，并計算相對標準偏差，色譜峰保留時間的RSD為0.19-0.2%，峰面積的RSD為1-2.25%，相似度在0.986-0.999之間（不包括自身比較），表明該方法重現性良好。

2.2.6 穩定性考察

用考察精密度的同一樣品，分別在0，2，4，6，8，12，16，24，36，48 h進樣，考察方法穩定性（樣品于室溫放置）。比較共有峰中，單峰面積大于5%總峰面積、分離效果較好的三個色譜峰的保留時間、峰面積，并計算相對標準偏差，相似度在0.997-1.000之間（不包括自身比較），表明供試液在24 h內穩定。

3 結果與分析

3.1 甘草斷面顏色測量結果

對34批甘草樣品分別進行斷面顏色值的測量，每個樣品重復測定三遍，記錄顏色指標的平均值，結果見表3。實驗選擇L*a*b*色空間中L*、a*、b*的值作為顏色測量指標。

3.2 甘草樣品HPLC指紋圖譜測定結果

將所有栽培甘草樣品指紋圖譜進行疊加，用色譜指紋圖譜相似度軟件對其進行分析，得到了甘草栽培品HPLC對照指紋圖譜，見圖5，共計74個色譜峰，其中共有峰20個，占總面積的92%；通過對所有甘草野生指紋圖譜進行分析，得到了野生甘草HPLC對照指紋圖譜，見圖6，經相似度軟件分析匹配后，共給出79個色譜峰，其中共有峰17個，占總面積91%，見表4。

表2 甘草HPLC檢測中流動相梯度條件及檢測波長

圖1 甘草對照品HPLC色譜圖

圖2 甘草栽培樣品HPLC色譜圖

圖3 甘草野生品HPLC色譜圖

圖4 精密度考察

表3 甘草斷面顏色測量指標值

表4 甘草HPLC指紋圖譜共有峰保留時間

結合表4和圖5及6可以看出，栽培甘草和野生甘草的HPLC指紋圖譜中大多數指紋峰的峰形、保留時間基本一致，差異主要集中在40 min之后的18、19、20號峰。

結合文獻[8]以及上述色譜圖可知色譜圖前段23 min以前以二氫黃酮苷、查爾酮苷和黃酮苷類成分為主，時間中段25 min到35 min以五環三萜類皂苷成分為主，40分鐘之后以香豆素類和黃酮類為主。以此為據，初步將1-10號峰劃為一組，其以黃酮苷類成分為主；將11-17號峰劃為一組，其以三萜皂苷類成分為主；將18-20號峰劃為一組，其以香豆素類成分為主。按照上述分類對34份甘草樣品進行總結。

圖5 栽培甘草HPLC對照指紋圖譜

圖6 野生甘草HPLC對照指紋圖譜

以各指紋圖譜中測得的甘草酸峰面積為1，計算各樣品圖譜中色譜峰的峰面積比值，求得三部分的相對峰面積和，結果見表5。

3.3 甘草斷面顏色指標值與HPLC指紋圖譜信息的典型相關分析

甘草樣品顏色指標值L*、a*、b*與HPLC指紋圖譜三組色譜峰相對峰面積和為兩組連續變量，且經過主成分檢驗法均符合多元正態分布[9]，符合典型相關分析的條件。運用SAS9.4對34份甘草樣品斷面顏色指標值L*、a*、b*與HPLC指紋圖譜三組色譜峰相對峰面積和做典型相關分析，得到3對典型變量（見表6）。典型相關系數用似然比法檢驗與0是否有顯著差異，結果顯示，第1、2典型相關系數具有統計學意義，第1、2典型相關系數分別為0.787035和0.603669，特征值的貢獻率分別為73.67%，25.95%，前兩對變量的累計貢獻率高達99.62%。結果表明甘草斷面顏色與HPLC指紋圖譜有顯著相關性。

4 討論

在對中藥材的質量控制上，多年來一直是通過對有效成分或指標性成分的含量測定來檢測。目前有關甘草質量評價的報道很多，主要以用HPLC測定甘草酸、甘草苷等指標成分為主[10-14]。

表5 甘草三組色譜峰相對峰面積和

盡管以化學成分作為評價中藥質量的標準更直觀，但這種方法需要滿足兩個前提，一是中藥材中所測得的的確是有效成分；二是所含的有效成分或指標成分的含量與所有有效成分的含量比是固定的。但是每一味中藥材中都含有多種成分，是一個復雜的系統，不同的有效成分以及有效成分不同的含量比例使每一味中藥材看起來更像一個中醫復方。因此，經過幾千年臨床驗證而總結的傳統藥材性狀仍具有很高的價值。

中藥色澤是中藥質量標準的重要指標之一，越來越多的學者關注了中藥及中藥飲片的顏色測量。鄒慧琴等[7]基于色度學理論建立了甘草斷面及表皮顏色指標數字化的方法；熊吟等[15]使用色度計對金銀花粉末進行測量，并結合藥材內部物質含量測定結果進行相關性分析，結果金銀花顏色值與所含總黃酮含量相關；謝晉等[16]發現丹皮飲片斷面的顏色b*值與飲片中所含丹皮酚的含量存在穩定的相關性。

表6 甘草斷面顏色與HPLC指紋圖譜的典型相關分析

通過中藥外觀色澤的客觀量化，有望建立一套具有中醫藥特色的中藥質量評價方法，為中藥現代化提供新思路。然而中藥飲片大多形態體積不一、表面粗糙不平，需要對測量面進行預處理，使色度測量具有一定困難。另外，對中藥的人為染色也是中藥“辯色論質”的新挑戰[5]。