枳葛口服液對酒精性肝病大鼠脂質代謝的影響＊

蔡麗君，劉友平，李 志，李 波，楊國川，魏 嵋＊＊

（1.西南醫科大學附屬中醫醫院 瀘州 646000；2.西南醫科大學基礎醫學院瀘州 646000；3.成都市新津縣中醫醫院 新津 611430）

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是指長期大量飲酒后所出現的肝臟病理性損傷，從病理形態學上將ALD分為幾種形式：輕癥ALD、酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和肝硬化五大類型[1-3]。其中酒精性脂肪肝是由于過量飲酒導致甘油三酯及膽固醇等在肝組織堆積，從而出現肝細胞脂肪變性的疾病[4]。現代研究證實，酒精性脂肪肝在酒精性肝損傷的病理發展過程中占有重要地位，并呈現逐漸增加的趨勢，因此脂質代謝在ALD進展中發揮的作用受到廣泛關注[5,6]。枳葛口服液是我院全國中西醫結合肝病著名專家教授經過長期臨床探索總結出的幾味藥食同源純中藥解酒經驗組方，具有解酒保肝、健脾利濕活血之功效，用于對長期大量飲酒造成的醉酒及預防酒精性肝損傷收到良好的效果，但具體作用機制不清楚。為了探討枳葛口服液的健脾利濕活血作用，本研究側重觀察枳葛口服液對酒精性肝損傷模型大鼠脂質代謝的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及藥品

清潔級SD雄性大鼠共90只，體質量170 g-210 g，由西南醫科大學實驗動物中心提供。枳葛口服液由西南醫科大學附屬中醫醫院制劑室提供，規格20 mL×6支/盒，處方組成：枳椇子、葛根、山楂等，有效期2年，批號20151026。解酒靈口服液由黃石市今陽保健品廠提供，規格10 mL×6支/盒，處方組成：甘草、枸杞子等，有效期18個月，生產批號20150401。

1.1.2 試劑

瀘州老白干購于中國·瀘州老窖股份有限公司，酒精度52%VOL，生產批號20150604。普通飼料由西南醫科大學實驗動物中心提供。蘇木素-伊紅（Hematoxylin and Eosin，HE）染液及丙氨酸氨基轉移酶（alartine arninotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、甘 油 三 酯（triglycerides，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模及給藥

SD雄性大鼠90只適應性喂養一周后隨機分為6組：正常組、ALD動物模型組（模型組）、枳葛口服液高劑量組（高劑量組）、枳葛口服液中劑量組（中劑量組）、枳葛口服液低劑量組（低劑量組）及解酒靈口服液陽性對照組（對照組），每組15只。每天9點灌胃：正常組采用蒸餾水灌胃1.0 mL/100 g/天，其余每組均給予52%瀘州老白干灌胃1.0 mL/100 g/天，同時高、中、低劑量三組各分別灌服枳葛口服液1.0 mL/100 g天、0.5 mL/100 g/天和0.25 mL/100 g/天，對照組灌胃解酒靈口服液0.5 mL/100 g/天。以上各組均自由飲水，普通飼料，每天20點以后禁食不禁水，持續12周。

1.2.2 標本采集

最后1次給藥后12 h禁食，用1%戊巴比妥鈉按照0.4 mL/100 g體重腹腔注射麻醉，腹主動脈取血后，4℃冰箱放置12 h后離心留取血清，-80℃冰箱保存，用于檢測ALT、AST、TG、TC；肝臟稱重后取部分肝左葉以4%甲醛固定，做HE病理染色；剩余肝組織用于檢測TC、TG含量。

1.2.3 指標檢測及統計學分析

計算肝臟指數，即肝臟指數＝完整肝臟濕重/體重×100%；HE染色觀察肝組織的結構；全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST、TG、TC含量；比色法檢測肝組織TC、TG含量。統計軟件SPSS 20.0進行數據分析，定量資料采用均數及標準差表示，組間對比采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小差異顯著性法（least significance of difference，LSD），檢驗水準α=0.05，當P＜0.05時認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織HE染色的比較

正常組大鼠肝小葉及細胞形狀大小結構均勻，邊界分明、呈現放射狀布列整齊規則；模型組大鼠肝小葉結構不規則，邊界模糊，細胞內可見大面積大小泡性脂肪空泡，部分細胞核偏移；高劑量組肝細胞結構接近正常組；與模型組相比，中劑量組和對照組均有所改善；模型組和低劑量組基本類似，見圖1。

2.2 各組大鼠肝臟指數的比較

圖1 各組大鼠HE染色鏡下圖（×400）

表1 各組肝臟指數的比較(S,n=15)

表1 各組肝臟指數的比較(S,n=15)

注：與正常組比較aP＜0.01，bP＜0.05；與模型組比較cP＜0.01，dP＜0.05；與對照組比較eP＜0.05。

肝臟指數2.056±0.211 3.417±0.231a 2.102±0.139ce 2.442±0.121bd 2.762±0.166a 2.51±0.32bd分組正常組模型組高劑量組中劑量組低劑量組對照組

表2 各組ALT、AST、TC、TG的比較(S,n=15)

表2 各組ALT、AST、TC、TG的比較(S,n=15)

注：與正常組比較aP＜0.01，bP＜0.05；與模型組比較cP＜0.01，dP＜0.05；與對照組比較eP＜0.05。

血清TG/（mmol/L）0.17±0.02 0.56±0.10a 0.27±0.04bce 0.43±0.07ad 0.47±0.07a 0.45±0.08ad分組正常組模型組高劑量組中劑量組低劑量組對照組ALT/（u/L）43.02±2.99 57.58±3.36a 46.±2.76ce 51.11±2.24bd 54.41±2.23a 51.98±2.16bd AST/（u/L）79.12±8.32 102.18±7.56a 84.26±7.93ce 91.06±7.39bd 94.82±7.22ad 92.80±7.42bd血清TC/（mmol/L）1.49±0.24 1.89±0.24a 1.58±0.22ce 1.77±0.22bd 1.84±0.29a 1.82±0.34bd

與正常組比較，除高劑量組外各組肝臟指數均顯著升高（P＜0.01或0.05）,其中模型組和低劑量組升高最為明顯（P＜0.01）。與模型組比較，各組肝臟指數在高、中、低劑量組及對照組均有所下降，但下降趨勢分別呈現一定的遞減趨勢，即枳葛口服液高劑量組下降最為明顯（P＜0.01），幾乎接近正常組；其次是中劑量組及對照組（P＜0.05）；低劑量組降低最不顯著。與解酒靈口服液對照組比較，僅高劑量組肝臟指數有顯著性差異（P＜0.05），中、低劑量組差異無明顯統計學意義（P ＞ 0.05）（表1、圖2）。

2.3 各組大鼠血清ALT、AST、TG、TC的比較

與正常組比較，除高劑量組外各組血清ALT、AST、TC、TG含量均顯著升高（P ＜0.01或0.05），其中模型組和低劑量組升高最為明顯（P＜0.01）。與模型組比較，ALT、AST、TC、TG血清含量在高、中、低劑量組及對照組均有所下降，且組間下降趨勢同以上肝臟指數的下降趨勢，即枳葛口服液高劑量組下降最為明顯（P＜0.01），其次是中劑量組及對照組（P＜0.05），低劑量組降低最不顯著。同樣與解酒靈口服液對照組比較，僅高劑量組血清ALT、AST、TC、TG含量有顯著性差異（P＜0.05），中、低劑量組差異無明顯統計學意義（P ＞ 0.05）（表2、圖3，4）。

2.4 各組大鼠肝組織TG、TC的比較

圖2 各組肝臟指數的比較

圖3 各組血清ALT、AST含量比較

圖4 各組血清TC、TG含量比較

與正常組比較，同樣除高劑量組外各組肝組織TC、TG含量均顯著升高（P＜0.01或0.05），其中模型組和低劑量組升高最為明顯（P＜0.01）。與模型組比較，肝組織TC、TG含量在高、中、低劑量組及對照組均有所下降，且組間下降趨勢及組間比較顯著性差異性比較均同以上肝臟指數及ALT、AST、TC、TG血清含量。同樣與解酒靈口服液對照組比較，僅高劑量組肝組織TC、TG含量有顯著性差異（P ＜0.05），中、低劑量組差異無明顯統計學意義（P ＞ 0.05）（表3、圖5）。

表3 各組肝組織TC、TG的比較(S,n=15)

表3 各組肝組織TC、TG的比較(S,n=15)

注：與正常組比較aP＜0.01，bP＜0.05；與模型組比較cP＜0.01，dP＜0.05；與對照組比較eP＜0.05。

肝組織TG/（mmol/L）2.48±0.33 3.91±0.30a 2.68±0.23ce 3.08±0.26bd 3.49±0.33a 3.15±0.36bd分組正常組模型組高劑量組中劑量組低劑量組對照組肝組織TC/（mmol/L）7.25±1.41 9.22±0.88a 7.71±0.90ce 8.28±0.65bd 8.83±0.93a 8.37±0.54bd

圖5 各組肝組織TC、TG含量比較

3 討論

ALD的發病機制復雜，如與能量代謝、氧化應激、免疫調節、脂質代謝等有關[5,7]；其中脂肪代謝異常是酒精性肝損傷發生的關鍵因素之一[4]。因為肝臟是脂類代謝的主要器官，不僅是合成甘油三酯、膽固醇等脂質物質最主要的場所，同時擔負著脂質的轉化與排泄等重要作用，因此當肝細胞功能受損時，將會影響血脂、脂蛋白及載脂蛋白的合成、轉運、代謝等生理代謝過程，導致機體脂代謝紊亂[8-10]。本研究通過單純酒精性肝損傷大鼠模型觀察枳葛口服液的解酒護肝機制發現：模型組不管從病理學改變（見圖1），肝臟指數（見表1，圖2）及明顯升高的ALT、AST、TC、TG（見表2，3及圖3，4，5），都充分說明在單純持續的乙醇刺激下大鼠因機體脂代謝紊亂而發生了較嚴重的肝脂肪變性，肝功能受損嚴重，這與其它相關類似實驗較一致[11-13]。這可能是乙醇在代謝的過程中產生的代謝產物乙醛及自由基等破壞肝細胞線粒體的氧化功能，導致肝細胞損傷、脂代謝紊亂而使TC、TG大量沉積在肝臟中[14]。當給予乙醇刺激的同時給予不同劑量枳葛口服液并解酒靈口服液做對照時，各實驗組大鼠肝臟指數、血清ALT、AST、TC、TG及肝組織中TC、TG均低于模型組，其中高劑量枳葛口服液組值最低并幾乎接近正常組值，對照組解酒靈口服液與中劑量枳葛口服液療效相當（見表1、表2、表3）。通過各組各數據柱狀圖發現，以上所有數據在這六組中的變化趨勢非常一致（見圖2、圖3、圖4、圖5），說明高劑量枳葛口服液（1.0 mL/100 g/天）確實能在飲酒人群中起到有效的降脂保肝作用。

中藥防治酒精性肝病優勢明顯，具有良好的應用前景[15-17]。我院著名中醫專家孫同郊教授結合西醫對酒精性肝病的理解，認為酒含濕熱之毒，濕熱隱伏于血分，導致氣滯、血瘀等失調性改變；濕困脾土，使脾失健運；故而認為“脾虛血瘀”是酒精性肝病的基本病機[18]。鑒于以上理解并經過幾十年的臨床探索，孫同郊教授總結出了具有明顯健脾利濕活血之功效的解酒經驗方——枳葛口服液，其組成藥方主要有：枳椇子、葛根、山楂等。相關研究證實：枳椇子水煎液可以顯著降低TC、TG[20,21]；葛根素是潛在的降血脂藥物，它能提高高脂血癥患者冠狀動脈血流，而葛根異黃酮能夠降低糖尿病小鼠血糖，改善小鼠體重，使血清TC、TG的含量降低，從而抑制糖脂代謝紊亂[21,22]；山楂含有黃酮類及解脂酶，它能明顯抑制膽固醇合成的限速酶活力，從而減少內源性膽固醇的生成，并且通過促使脂肪分解、清除，從而降低血脂[23,24]。可見，枳葛口服液的健脾利濕活血之功效可能與其改善大鼠脂質代謝紊亂密切相關，從而防止肝臟發生進一步肝脂肪變性。

綜上所述，早期、定量的枳葛口服液對酒精性肝損傷有一定的阻斷或抑制作用，其機制可能與改善大鼠脂質代謝紊亂有關；為了更好地為廣大飲酒人群提供安全可靠、行之有效的保健制劑，我們擬對枳葛口服液的保健機制做進一步研究以期為其保健功能評價及開發利用提供一定的科學依據。