頤腦解郁復方對卒中后應激大鼠腸道菌群的影響＊

劉海鵬，李小黎＊＊，田會玲，孫新月，林亮吟，陳弘婧，張淑靜

（1.北京中醫藥大學第三附屬醫院 北京 100029；2.北京中醫藥大學中醫學院 北京 100029）

卒中后抑郁（Post-stroke Depression，PSD）是臨床腦卒中后常見并發癥。大樣本臨床研究顯示，PSD對腦卒中患者神經功能康復、生活質量和生存率有重要影響，明顯加重患者、家庭及社會的經濟負擔，目前受到越來越多的重視[1]。本課題組以往的研究結果表明，頤腦解郁復方對PSD大鼠抑郁癥狀具有明顯改善作用[2]；另有研究表明，腸道菌群失調是神經精神障礙疾病發病的關鍵因素之一，腸道內微生物群落的種類、組成和數量的平衡與焦慮、抑郁等疾病相關[3][4]。本研究擬從卒中后應激大鼠腸道菌群的改變探討頤腦解郁復方對PSD的干預機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及實驗環境

實驗動物由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號為SCXK（京）2012-0001，飼養于北京中醫藥大學動物實驗室，室溫（20±2）℃、相對濕度50%-60%，光照明暗交替12 h/12 h，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

頤腦解郁復方由北京中醫藥大學第三附屬醫院提供；對照藥物為鹽酸氟西汀膠囊，由禮來蘇州制藥有限公司提供，藥品批號為：國藥準字J20170022。

1.3 主要試劑與儀器

Nanodrop（美國Thermo Scientific公司，型號NC2000），PCR擴增儀（美國ABI公司，型號2720），酶標儀（美國BioTek公司，型號FLX800T），電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號DYY-6C），凝膠成像系統（北京百晶生物技術有限公司，型號BG-gdsAUTO(130)），Agarose（美國 Invitrogen公司，貨號 75510-019），Q5? High-Fidelity DNA Polymerase（美國 NEB公司，貨號 M0491L），Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（美國Invitrogen公司，貨號P7589），Marker（日本Takara公司，貨號DL15000或DL2000），TAE（美國Invitrogen公司，貨號AM9870），戊巴比妥鈉（美國Sigma公司，貨號P3761-5），栓線（北京西濃科技有限公司，貨號2838-A4），曠場試驗用敞箱（自制），強迫游泳試驗用水箱（自制）。

2 實驗方法

2.1 分組及給藥

健康SD雄性大鼠48只，清潔級，300±20g，適應性喂養1周。1周后根據體重隨機分組，分為假手術組、卒中后應激組、西藥組和中藥組，每組各12只。假手術組只分離血管不插入線栓，卒中后應激組、西藥組和中藥組均在大腦中動脈阻塞術（middle cerebral artery occlusion，MCAO）后7天進行卒中后應激模型制備。根據大鼠體重計算氟西汀膠囊、頤腦解郁復方藥液每日灌胃量，自應激開始至實驗結束。中藥組每日灌胃1次，根據此前研究[2]確定灌胃劑量為9.92 g/（kg·d）；西藥組每日予氟西汀溶液每日等容積混懸液灌胃1次，按照成人用量7倍計算大鼠用量為2.33 mg/（kg·d）；余下各組均每日給于蒸餾水10 ml·kg-1灌胃1次。

2.2 模型制備

2.2.1 卒中模型的制備

采用MCAO所致的局灶性腦缺血模型。大鼠麻醉后，按照Bederson等的方法，將尼龍線栓從頸內動脈小口輕輕插入至Willie's環大腦前動脈起始處；假手術組只游離血管不插線。結扎、縫合。2 h后將腦卒中模型大鼠尼龍線輕柔拔出1 cm左右，剪掉暴露于皮膚外的栓線。腦卒中模型大鼠入選的標準（按照ZeaLonga5級評分法取評分為1、2、3分的大鼠）：大鼠于缺血2h后出現腦缺血對側前肢倦曲或行走轉圈或行走向對側倒體征則納入，大鼠無此體征或于2 h后仍不清醒者棄去。

2.2.2 卒中后應激大鼠模型的制備

制備局灶性腦缺血復合孤養、束縛應激的卒中后應激大鼠大鼠模型。缺血性腦卒中模型制備成功后，待術后7 d大鼠神經功能缺損癥狀稍恢復后，即將卒中后應激大鼠組、西藥組和中藥組大鼠固定在特制的T型束縛臺上（自制），連續7 d，每天于10:00-16:00期間任取時間，予以2 h的行為限制，并予以單籠飼養直至實驗結束。

2.3 行為學觀察

2.3.1 蔗糖水試驗

實驗第14 d末，各組進行蔗糖水試驗。試驗前，先給予20小時的禁食禁水，然后同時給予每只大鼠事先定量好的兩瓶水：一瓶l%蔗糖水，一瓶普通飲用水。30分鐘后調換蔗糖水和純水的位置，60分鐘后取走兩瓶并稱量。計算大鼠糖水消耗比例（蔗糖水偏愛）=糖水消耗量/總液體消耗量。

2.3.2 曠場試驗

實驗第14 d末，進行曠場試驗。將大鼠置于場箱中心方格內，觀察大鼠在3分鐘內穿越格數（為水平運動得分，四爪均進入方格時方可記數一次）、后肢直立次數（為垂直運動得分，兩前爪騰空或攀附墻壁時記數一次）。

2.3.3 強迫游泳試驗

實驗第14 d末，進行強迫游泳試驗。在大鼠禁食2l h后進行。水深25 cm，水溫25±1℃，大鼠在水中不能以后爪支撐身體，也不能以前爪攀附于缸壁，連續觀察5 min，累計大鼠在水中游泳時間和停止掙扎、呈漂浮狀態的時間。每只大鼠僅進行一次實驗。

2.4 腸道菌群種類及豐度的差異研究

所有大鼠分別在實驗第14 d末，行為學測試前，在超凈工作臺，通過揉腹等方法促使大鼠排便，每只大鼠至少取兩粒糞便，每粒糞便置于無菌凍存管中，保存于-80℃環境中。使用宏基因組DNA提取試劑盒提取糞便中的總DNA；以細菌16SrDNA基因的V3-V4可變區序列為靶標，以帶有barcode序列的338F-806R為引物，進行PCR擴增，獲取PCR產物；PCR產物經過定量及文庫構建后，利用IlluminaMiSeqPE300平臺進行高通量測序，獲取細菌16SrDNA基因的V3-V4可變區堿基序列信息；利用QIIME軟件，對測序片段進行OTU（分類學操作單元）聚類，OUT代表序列與silva數據庫進行比對分析，獲取OUT對應的分類單元（包括門綱目科屬種）及其相應的豐度。聚類后的目標序列按照97%的相似度計算數量，同時采用眾數原則對每一個操作分類單元進行物種注釋，對各樣本（組）在不同分類水平的具體組成進行分析（并檢驗組間是否具有統計學差異）。

表1 各組大鼠行為學變化結果（s，n=6）

表1 各組大鼠行為學變化結果（s，n=6）

注：與假手術組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01；與PSD組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01。

游泳掙扎時間/s（強迫游泳試驗）277.17±4.62 251.33±10.57▲▲257.17±20.49▲266.83±2.92*9.92 0.00組別假手術組卒中后應激組西藥組中藥組F值P值蔗糖水偏好度（蔗糖水試驗）0.80±0.04 0.66±0.05▲▲0.74±0.07 0.72±0.11 3.81 0.03曠場水平得分65.00±7.40 48.17±7.93▲▲61.83±15.42*61.67±5.12*10.63 0.02曠場垂直得分15.00±2.44 11.17±2.31▲▲13.17±1.47 13.33±1.96 3.40 0.04

圖1 菌群分類學組成和分布圖

3 數據處理與統計學分析

應用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，實驗數據以平均數±標準差表示，方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，方差不齊用Welch法分析，兩兩比較用LSD法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

4 實驗結果

4.1 蔗糖水試驗結果

卒中后應激組大鼠與假手術組相比較，其蔗糖水偏好度顯著下降，差異具有統計學意義（P＜0.01）；西藥組與卒中后應激組，中藥組與卒中后應激組，中藥組與西藥組之間的對比差異均無統計學意義（P＞0.05）。結果見表1。

4.2 曠場試驗結果

卒中后應激組大鼠與假手術組相比較，其水平得分和垂直得分均顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.01，P＜0.01）；卒中后應激組與西藥組和中藥組相比較，水平得分均顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.05）；卒中后應激組與西藥組和中藥組相比較，垂直得分降低，但差異不具有統計學意義（P＞0.05，P＞0.05）；中藥組與西藥組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）（表1）。

4.3 強迫游泳試驗結果

卒中后應激組與假手術組和中藥組相比較，游泳掙扎時間減少，差異具有統計學意義（P＞0.01，P＞0.05）；西藥組與假手術組相比較，游泳掙扎時間減少，差異具有統計學意義（P＞0.01）；卒中后應激組與西藥組相比較，游泳掙扎時間減少，但差異不具有統計學意義（P ＞ 0.05）（表1）。

4.4 菌群分類學組成的分布特征及菌群變化

在“屬”水平上，菌群分類學組成和分布的結果顯示，各組大鼠腸道菌群中具有明確分類的菌屬共68種，其中Lactobacillus、Bacteroides、Blautia等18種菌屬在數量上占絕對優勢，占97.2%，其他50種劣勢菌屬因其含量過少，合記為Others（見圖）。①與假手術組相比，卒中后應激組中Allobaculum、Sutterella、Dorea和rc4-4比例顯著下降（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）；Oscillospira比例顯著上升（P ＜0.01）。②與卒中后應激組比較，中藥組大鼠糞便中Lactobacillus、Bacteroides、Parabacteroides、Roseburia、Dorea和 rc4-4比例顯著升高（均P＜0.01），Oscillospira比例顯著降低（P ＜0.05），其中以Lactobacillus和Bacteroides差距最為明顯，分別為27.91%vs5.96%和24.21%vs9.62%。③與西藥組相比，中藥組大鼠糞便中Bacteroides，rc4-4比例顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）（表2）。

表2 各組腸道菌群之間的比較檢驗結果（s,n=6）

表2 各組腸道菌群之間的比較檢驗結果（s,n=6）

注：與假手術組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與卒中后應激組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與西藥組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

P值0.00 0.00 0.06 0.25 0.18 0.00 0.02 0.11 0.00 0.03 0.035 0.00 0.08 0.00 0.24 0.00 0.84 0.66組別菌屬Lactobacillus Bacteroides Blautia Enterococcus Prevotella Allobaculum Oscillospira[Prevotella]Sutterella Roseburia Coprococcus Dorea Ruminococcus Parabacteroides Clostridium rc4-4 Phascolarctobacterium[Ruminococcus]假手術組2.56±2.44 10.68±5.51 15.03±7.14 0.02±0.03 6.04±3.47 29.55±7.77 2.35±1.05 18.64±17.77 7.80±4.39 0.26±0.28 0.45±0.22 1.75±1.29 0.67±0.22 0.41±0.16 0.50±0.38 0.95±0.61 0.45±0.80 0.45±0.48卒中后應激組5.56±3.41 9.62±2.88 12.21±12.39 35.75±39.70 8.75±8.87 1.45±1.33▲▲9.71±8.10▲▲4.42±4.26 0.40±0.31▲▲0.63±0.82 2.90±2.63▲0.22±0.06▲▲2.92±2.64 0.69±0.28 0.54±0.56 0.19±0.15▲1.07±1.37 1.07±1.37西藥組25.56±18.89▲▲**11.67±7.31 18.31±19.43 0.03±0.04 9.52±9.51 3.49±2.87▲▲5.03±1.54 2.95±2.06 4.15±1.68▲*5.49±5.67 1.66±1.61 1.30±0.66**1.60±1.55 0.96±0.38▲▲1.64±1.44 0.69±0.42 0.86±1.40 0.85±0.81中藥組27.91±14.40▲▲**24.21±5.23▲▲**##5.91±1.75 0.04±0.05 3.42±1.32 2.73±3.06▲▲3.42±1.86*8.01±5.41 1.30±1.07▲▲9.33±6.89▲▲**1.74±1.12 1.59±0.52**1.58±1.02 1.28±0.42▲▲**1.78±2.01 1.36±0.59**#1.04±1.54 1.04±0.89 F值9.92 9.37 8.78 10.33 9.17 9.89 10.39 9.78 8.92 8.91 8.66 8.46 2.58 7.93 10.03 6.30 0.29 0.54

5 討論

近期流行病學研究顯示，卒中后五年內，PSD的綜合發生率為31%[5]。PSD的發生常伴有腸道功能障礙，出現體重減輕、腹瀉、食欲差等癥狀，嚴重影響腦卒中后的恢復、加重抑郁癥狀[6]。本研究行為學結果顯示，與假手術組相比較，卒中后應激組大鼠蔗糖水偏好度、曠場得分和游泳掙扎時間均顯著降低，表明卒中后應激大鼠對美好事物的向往和陌生環境的好奇程度均明顯下降，而在危險情況下的絕望程度增加，從而說明了卒中后應激大鼠處于應激狀態。與卒中后應激組相比較，中藥組大鼠水平得分和游泳掙扎時間顯著升高，提示頤腦解郁復方在一定程度上改善了卒中后應激大鼠的應激癥狀。

PSD的發生與大腦關系密切，而腸腦軸（gut-brain axis）是胃腸道與大腦之間復雜的雙向調控通路，其整合了胃腸道和大腦間的營養、內分泌、神經傳導和免疫學信號傳輸[7-9]，腸道菌群是這條通路的重要參與者，因此也有研究稱其為“微生物-腸-腦軸”[10-12]。腸道內的自然菌群,如乳酸菌、擬桿菌、雙歧桿菌等，以相對恒定的比例長期定植在固定區域，通過自身代謝改變周圍環境的成分,從而維持腸道菌群的動態平衡。本研究結果顯示，與卒中后應激組相比，中藥組大鼠糞便中Lactobacillus、Bacteroides、Parabacteroides、Roseburia、Dorea和rc4-4比例顯著升高，Oscillospira比例顯著降低，其中以乳桿菌屬（Lactobacillus）和擬桿菌屬（Bacteroides）比例提升最為明顯；與西藥組相比，中藥組大鼠糞便中Bacteroides和rc4-4比例顯著升高。研究表明[13]，乳酸菌可通過調節腸道免疫、促進神經信號物質產生、調節內分泌細胞激素等方面的作用來緩解和預防精神性疾病；腸道乳桿菌屬減少、腸球菌等需氧菌異常增加參與抑郁的發生過程[14]，而益生菌治療后，腸道菌群失調得到改善，患者的抑郁癥狀減輕[15]。另有研究發現，注射瑞士乳桿菌NS8可改善大鼠慢性束縛應激引起的行為、認知和生化異常，這種作用可能與微生物-腸-腦軸有關[16]。國外研究發現，擬桿菌對多糖的利用尤為突出，能幫助宿主高效的分解多糖，從而提高其營養利用率[17]。擬桿菌還在維持腸道菌群動態平衡[18,19]，提高宿主免疫力[20]，促進腸黏膜血管的生成和發育[21]等方面具有重要作用。由以上可知，乳桿菌屬和擬桿菌屬具有良好的益生作用，而乳桿菌屬和擬桿菌屬占據了中藥組大鼠腸道菌群（已知種類）52.12%的含量，從而說明，頤腦解郁復方可通過增加乳桿菌屬和擬桿菌屬的含量促進腸道菌群動態平衡的恢復，進而改善大鼠的類似抑郁癥狀。此外，與西藥組相比，中藥組大鼠糞便中擬桿菌屬（Bacteroides）含量明顯升高，提示頤腦解郁復方對于腸道菌群動態平衡的恢復可能優于鹽酸氟西汀膠囊。目前關于Oscillospira、Parabacteroides、Roseburia、Dorea、和rc4-4的研究尚不深入，有待進一步研究。

頤腦解郁方為本課題組前期治療PSD的中藥復方，含5味中藥（君藥-刺五加；臣藥-五味子、郁金；佐藥-梔子、川芎），具有益氣舒肝，調氣活血的作用。從中醫角度來講，PSD的中醫病機為脾腎虧虛，氣滯痰瘀，病位在腎、肝、脾三臟，而“腎司二便，肝主疏泄，肝與大腸相別同，脾主升清降濁”，腎、肝、脾三臟均可從不同角度調節腸道功能，因此頤腦解郁復方可以通過調節腎、肝、脾的功能間接起到調節腸道功能的作用，從而改善腸道菌群。從單味藥現代研究來看，刺五加、五味子和梔子已經被證實具有調節動物腸道菌群的作用。研究發現，刺五加能有效升高犢牛消化道內雙歧桿菌、乳酸桿菌的數量,促進犢牛腸道內有益菌菌群的生長和增殖[22]；刺五加提取物有助于升高斷奶仔豬腸道內容物乳酸桿菌的數量,抑制大腸桿菌增殖,顯著增加腸道微生物的多樣性[23]；五味子能有效地調整肝硬化大鼠的腸道菌群，并降低其肝損傷，是一種理想的微生態調節劑[24]；梔子中、高劑量對大鼠腸道內腸桿菌具有一定的抑制作用，但不影響雙歧桿菌和乳酸桿菌的數量，提示梔子沒有導致大鼠腸道菌群失調，而是起到了改善其腸道菌群的作用[25]。雖然沒有研究證實郁金和川芎具有調節腸道菌群的作用，但郁金和川芎都具有調節肝膽的作用，猜測其可能具有通過調節膽汁分泌間接影響腸道菌群的作用。綜上所述，可以推測頤腦解郁復方通過增加了卒中后應激大鼠腸道中乳桿菌屬（Lactobacillus）和擬桿菌屬（Bacteroides）的數量，從而減輕了其抑郁癥狀，其相關機制尚待進一步深入研究。