PIK3R1基因及其編碼蛋白在宮頸鱗癌中的表達及臨床意義

楊佩芳，丁小星，于駿，陳霞

（江蘇大學附屬醫院婦科，江蘇鎮江212001）

我國女性宮頸癌發病率和死亡率呈逐年上升的趨勢［1］。宮頸鱗狀細胞癌是宮頸癌最多的病理類型，約占 80%以上［2］。

磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）是磷脂激酶中的一個家族，是細胞應答并且傳遞細胞間信號的重要協調者［3-4］。根據結構不同，PI3K分為三類，包括Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類。PIK3R1是Ⅰ類PI3K的調節亞基之一，編碼p85α蛋白。研究顯示，乳腺癌中存在p85α表達缺失，該缺失致PI3K活性增強，最終導致腫瘤的發生［5］。p85α能夠直接與人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（PTEN）相互作用，增強PTEN脂質磷酸酶活性從而負向調節腫瘤的發展，而PTEN基因的缺失、突變、甲基化與腫瘤的發生密切相關，其通過抑制磷酸化酶的活性而抑制腫瘤的發生發展，廣泛認為是一種抑癌基因。但是，p85α蛋白在宮頸癌中的表達情況尚不清楚。因此，本研究通過檢測p85α蛋白及其編碼基因PIK3R1在宮頸鱗癌組織中的表達，探討其與宮頸鱗癌發病的關系，并檢測PTEN在宮頸鱗癌中的表達水平，分析PTEN與PIK3R1在宮頸鱗癌中的表達是否存在相互關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

38例宮頸鱗癌和39例良性宮頸石蠟包埋組織取自江蘇大學附屬醫院病理科。宮頸腫瘤病理類型由江蘇大學附屬醫院病理科醫師依據顯微鏡下宮頸組織形態確診。按照FIGO分期，其中Ⅰ期16例，Ⅱ期12例，Ⅲ+Ⅳ期（晚期）共10例。年齡34～82歲，平均年齡（55.47±12.22）歲。同時收集 2017年1月至12月于江蘇大學附屬醫院婦科門診行宮頸活檢術的新鮮宮頸（術后石蠟病理確診為宮頸鱗癌）組織標本19例，患者年齡38～75歲，平均（54.11±10.80）歲；另選擇同期因子宮良性疾病行全子宮切除手術的良性宮頸組織19例，作為對照，患者年齡38～70歲，平均（47.21±7.16）歲。本研究經江蘇大學附屬醫院生物醫學倫理委員會批準，所有臨床標本經患者同意后獲取。

病例入選標準：石蠟病理切片確診為宮頸鱗癌；有至少2名經驗豐富的婦瘤醫師評估得出準確FIGO分期；病例排除標準：已接受過惡性宮頸腫瘤的治療（新輔助放療、化療）；有其他實體惡性腫瘤、血液系統疾病的存在。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 手術切除的組織立即放置于冰上，生理鹽水沖洗去除血凝塊及宮頸黏液和分泌物，并于20 min內送至本院中心實驗室-80℃保存。

1.2.2 組織HE染色 蠟塊切片，透明，置于梯度乙醇（濃度分別為95%、85%、75%）中各2 min，蒸餾水洗凈，蘇木精溶液染色10 min，流水沖洗1min；然后浸入1%鹽酸乙醇10～20 s，水洗1min，溫水藍化1 min，水洗2 min，切片置于75%乙醇中浸1min，伊紅染色1 min，置于梯度乙醇（濃度分別為85%和95%）中各1 min，100%乙醇脫水5 min，二甲苯透明，滴樹膠，封片，顯微鏡下進行觀察。

1.2.3 免疫組織化學檢測p85α蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達

1.2.3.1 實驗步驟 蠟塊切片脫蠟，依次置于濃度分別為100%、95%、85%、75%乙醇中浸泡5 min；切片置于沸騰的枸櫞酸緩沖液中5 min行抗原修復，待其自然冷卻；Tween-20細胞通透，增加細胞通透性，減少背景著色；3%H2O2消除內源性過氧化物酶；山羊血清滴于組織切片，濕盒常溫孵育25 min，封閉非特異性蛋白；滴加一抗（兔抗人p85α多克隆抗體1∶40），PBS代替一抗作為陰性對照，4℃孵育過夜；PBS沖洗、滴加二抗（羊抗兔IgG，即用型），室溫孵育25 min；PBS沖洗，DAB顯色，當組織顏色變為巧克力樣色時加PBS溶液終止反應；蘇木精復染2 min，流水沖洗；置于1%鹽酸乙醇中5 s，流水沖洗；溫水返藍5min，流水沖洗；脫水、二甲苯透明、封片、顯微鏡下進行觀察。其中，兔抗人多克隆抗體p85α、羊抗兔IgG聚合物均購于上海生工生物工程有限公司；DAB顯色液、Tween-20為福州邁新公司。

1.2.3.2 結果評定 組織陽性染色標準為細胞質中出現顆粒狀或成片的巧克力樣著色。400×高倍鏡下隨機選取10個視野，觀察陽性細胞所占的比例，取平均值。根據著色細胞百分比及細胞著色深淺分別計分判定結果：陽性細胞百分比＜10%為0分，10%～29%為1分，30%～49%為2分，≥50%為3分；細胞著色深淺：0分為不著色，1分為淺棕色，2分為棕黃色，3分為鐵銹色。兩項得分相乘即為總得分：＜3分為陰性，≥3分陽性。

1.2.4 RNA提取、逆轉錄、實時熒光定量 PCR（qRT-PCR） Trizol法提取組織總RNA，紫外分光光度計檢測總 RNA的 D（260 nm）／D（280 nm）值，并保證值為1.8～2.1。然后進行反轉錄，10μL體系中加入5×緩沖液 2μL，反轉錄酶0.5μL、寡核苷酸（50μmol／L）0.5μL，6核苷酸的隨機引物（100μmol／L）0.5μL，總 RNA為 500 ng／RNA濃度，不足部分加入無RNA酶水補充，反轉錄條件：37℃15 min，85℃5 s，4℃恒溫。10μL的qRT-PCR總反應體系中包括熒光染料混合液5μL，上、下游引物各 0.2μL，cDNA模板 0.4μL，其余部分用無RNA酶水補充。目的基因PIK3R1、PTEN及內參GAPDH的引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列及擴增長度見表1。反轉錄和實時熒光定量PCR試劑盒購于TaKaRa公司，操作步驟按照試劑盒說明書進行，檢測儀器為Agilent Mx3000P（美國Stratagene公司）。

1.2.5 基因相對表達水平 實驗以GAPDH作為內參照，采用相對定量方法進行分析，采用2-△△Ct的方法計算PIK3R1和PTEN在宮頸鱗癌組織中的相對表達水平。

表1 引物序列及擴增長度

1.3 統計學分析

采用GraphPad Prism 6.0作圖進行分析，采用SPSS 22.0進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，p85α在良性宮頸組織和宮頸鱗癌組織中的陽性率采用卡方檢驗、PIK3R1和PTEN表達相關性采用Pearson相關分析、宮頸鱗癌組織中p85α的表達與各臨床參數的相關性采用Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織HE染色結果

良性宮頸由鱗狀上皮細胞、鱗柱狀上皮交接和柱狀上皮細胞組成，細胞形態結構完好，細胞核無增大且細胞無變形。宮頸鱗癌組織中，腫瘤未累及的宮頸鱗狀上皮細胞異型嚴重，甚至消失，見較多形態異常、染色加深的藍紫色細胞核，腫瘤累及的宮頸正常形態結構消失，由不同程度增生的異型腫瘤細胞取代，腫瘤細胞核增大、變形、分裂，細胞核染色變深，腫瘤細胞呈團塊狀聚集。見圖1。

圖1 良性宮頸組織和宮頸鱗癌組織形態（HE染色×40）

2.2 p85α在宮頸鱗癌組織和良性宮頸組織中的表達

免疫組化結果顯示，p85α蛋白在良性宮頸組織中高表達，主要表達于細胞質中。p85α蛋白在宮頸復層鱗狀上皮的基底細胞中表達更多，在宮頸鱗癌細胞中表達較少，甚至不表達。見圖2。與良性宮頸組織相比，p85α在宮頸鱗癌組織中的表達顯著降低（t＝6.034，P＜0.01）。見圖3。

圖2 宮頸鱗癌組織和良性宮頸組織中p85α蛋白的表達

圖3 p85α蛋白在良性宮頸組織和宮頸鱗癌組織中的表達評分

p85α在良性宮頸組織和宮頸鱗癌組織中分別有35例（89.7%，35／38）和 17例（44.7%，17／38）呈陽性表達，宮頸鱗癌組中p85α陽性表達率顯著低于良性宮頸組（χ2＝17.781，P＜0.01）。

2.3 p85α在宮頸鱗癌中的表達與各臨床參數的關系

p85α的表達與臨床病理分期及轉移情況具有相關性（P＝0.001，0.016），病理分期越高，p85α表達越低；有遠處轉移的腫瘤組織中p85α表達較無遠處轉移的腫瘤組織表達低；但尚不能表明其表達與年齡和分化程度有相關性（P＞0.05）。見表2。

表2 p85α在宮頸鱗癌組織中的表達與各臨床參數的關系

2.4 PIK3R1和PTEN基因在宮頸鱗癌組織中的表達

qRT-PCR結果顯示，與良性宮頸組織相比，PIK3R1和PTEN在宮頸鱗癌組織中表達均明顯下調（PIK3R1 mRNA：t＝8.266；PTEN mRNA：t＝5.172，P均 ＜0.01）。見圖4。

圖4 PIK3R1和PTEN在宮頸鱗癌組織中的表達

2.5 宮頸鱗癌組織中PIK3R1和PTEN表達相關性分析

相關性分析顯示，PIK3R1和PTEN兩者表達呈中等相關（r＝0.567，P＝0.011）。

3 討論

PI3K是一個復雜的大家族，其通過與細胞膜上的受體作用，介導外部信號傳遞入細胞內部，進而影響細胞的增殖、存活和葡萄糖代謝等過程［6］。PI3K異常表達與腫瘤發生密切相關［7-8］，因此，近來PI3K廣泛用來作為潛在的腫瘤治療靶點。PIK3R1是Ⅰ類PI3K的調節亞基，共編碼3種蛋白，分別是p85α、p55α、p50α，其中，p85α蛋白結構具有完整性。因此，p85α能夠直接與PTEN基因結合并增強PTEN脂質磷酸酶活性［9］，從而抑制腫瘤的發展。

以往有研究顯示，p85α在實體惡性腫瘤中表達下調，本實驗結果顯示，p85α在宮頸鱗癌組織中顯著下調，且隨分期升高表達越低；此外，p85α在轉移宮頸鱗癌組織中較無轉移宮頸鱗癌組織表達更低，由此表明，p85α低表達在宮頸侵襲的過程中可能發揮負面作用。研究報道，PIK3R1在多種實體惡性腫瘤中表達下調，通過抑制腫瘤細胞的生長發揮抑癌基因的作用［10］，也有研究發現PIK3R1減少的程度與腫瘤的分期及預后顯著相關［11］，這些研究表明PIK3R1在一些腫瘤中發揮抑癌基因作用。本實驗結果顯示，與良性宮頸組織相比，PIK3R1在宮頸鱗癌中的表達水平顯著降低，可能在宮頸鱗癌的發生過程中發揮負面作用。

研究發現，PTEN能夠抑制PI3K的活性，其作為磷酸酯酶將磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3）轉化為磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2），致PI3K的產物減少，通過負調節PI3K的信號傳導過程，抑制PI3K通路的異常活化。本實驗通過相關性分析發現，PIK3R1與PTEN在宮頸鱗癌中的表達呈中等相關，但兩者是否通過相關途徑發揮作用，還需后續深入研究。

宮頸鱗癌組織中p85α及其編碼基因PIK3R1表達均顯著降低，且p85α表達與腫瘤的進展與侵襲相關，因此，我們認為p85α的缺失可能參與宮頸鱗癌的發生，并且PIK3R1可能與PTEN相互作用，共同發揮抑癌基因的角色，具體作用機制還有待進一步研究。