小腦鋅指結構5在結腸癌中的蛋白表達及預后評估價值

陸峰，劉成宸，陳威鵬，顏勛，韓瑋

（1.濱海縣人民醫院普外科，江蘇鹽城224000；2.江蘇大學附屬昆山醫院普外科，江蘇昆山215300）

雖然目前手術根治已成為結腸癌的主要治療手段，但術后患者5年生存率并不滿意。因此，探索可靠的生物學指標對結腸癌患者手術根治后進行隨訪和評估有著積極的作用［1］。小腦鋅指結構5（zinc finger protein of the cerebellum 5，ZIC5）是 ZIC家族的重要成員，其表達的ZIC5蛋白相對分子質量為68.4 kDa，主要在神經系統發育中發揮作用［2］。最近，相關文獻報道，ZIC5基因在非小細胞肺癌中發揮著癌基因的作用［3］。本實驗旨在通過免疫組織化學法檢測ZIC5蛋白在結腸癌組織中的表達，分析其表達水平與患者的臨床病理參數的關系以及ZIC5蛋白對預后的評估價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集從2010年1月至2012年12月于濱?？h人民醫院普外科行結腸癌根治術的76例患者切除的組織標本。所有術后病理組織均由兩名高年資病理學醫師確認診斷，且每例組織均包含癌組織及對應癌旁組織。所有病例均包含完整臨床病理資料及預后資料，所有患者術前均未接受任何放化療處理。其中，男34例，女42例，平均年齡為（54.8±14.8）歲，隨訪時間為3～60個月。

1.2 主要試劑

兔抗人ZIC5蛋白多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；免疫組織化學檢測試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 切片制作及免疫組織化學法

選取每例組織經病理學確診的特征性部位，固定、洗滌、脫水及透明后，浸蠟和包埋組織，用于長期保存。采用5μm厚度切片機對石蠟組織進行切片。以ZIC5蛋白抗體為一抗工作液，稀釋比例為1∶100，進行免疫組化實驗：①60℃烤箱脫蠟及水化；②高溫修復切片抗原；③試劑液A（內源性過氧化物酶阻斷緩沖）和B（正常山羊血清）封閉后，孵育一抗，4℃過夜；④PBS洗凈后孵育二抗（試劑液C，山羊抗兔／小鼠IgG抗體）及試劑液D（辣根過氧化酶標記鏈菌素）；⑤ DAB顯色；⑥ 蘇木素復染；⑦脫水透明及封片烘干；⑧鏡下觀察，拍照記錄。應用免疫組化評分法（immunoreactive score，IRS）評估染色結果。按染色強度記分：未染、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別對應0、1、2、3分；按陽性細胞占比記分：1%～10%計1分，11%～20%計2分，21%～30%計3分，依此類推，91%～100%計10分；IRS＝染色強度分數×陽性細胞占比分數，以10分為截斷值，IRS＞10為陽性。另外，以PBS替代一抗作為陰性對照。

1.4 統計學方法

所有數據分析均采用SPSS 20.0軟件和Graphpad 6.0軟件，計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用成組配對t檢驗。采用Kaplan-Meier法分析5年總體生存期及無病生存期，并利用Log-Rank檢驗及Cox回歸模型進行預后分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZIC5蛋白在結腸癌組織中的表達

ZIC5蛋白在結腸癌組織中主要分布在癌細胞核，陽性表達率為 71.05%（54／76），平均相對表達量為16.44±8.02；在癌旁組織中ZIC5蛋白亦分布在細胞核（圖 1），陽性表達率為 23.68%（18／76），平均相對表達量為6.63±5.14。ZIC5蛋白在結腸癌組織平均表達量顯著高于癌旁組織（t＝8.076，P＜0.01）。

圖1 ZIC5蛋白在結腸癌組織及癌旁正常組織中的表達（免疫組化法×200）

2.2 ZIC5蛋白表達與結腸癌患者臨床病理參數的關系

在76例結腸癌患者中，ZIC5蛋白表達陽性與患者高齡（P＝0.005）、癌組織低分化（P＜0.01）、淋巴結轉移（P＝0.009）以及 Dukes C期（P＝0.015）密切相關，而與患者性別、結腸癌體積無明顯相關（均 P＞0.05）。見表1。

2.3 ZIC5表達對結腸癌患者預后的影響

76例結腸癌患者Kaplan-Meier法分析結果見圖2。22例ZIC5表達陰性患者5年總體生存期平均為（44.32±4.61）月，54例 ZIC5表達陽性患者為（25.11±2.79）月。ZIC5陰性患者5年總體生存期明顯長于陽性病例（P＜0.01）；ZIC5陰性患者平均無病生存期為（41.86±4.93）月，ZIC5陽性患者為（21.28±2.68）月，ZIC5陰性患者無病生存期亦明顯高于陽性病例（P＝0.001）。見圖2。

表1 ZIC5蛋白在結腸癌中的表達與臨床病理參數的關系

圖2 ZIC5蛋白表達對結腸癌患者5年生存期影響的Kap lan-M eier分析

Cox回歸分析顯示，ZIC5蛋白表達水平（總體生存期：HR＝2.34，95%CI 1.22～4.46，P＝0.010；無病生存期：HR＝1.91，95%CI 1.31～2.79，P＜0.01）、淋巴結轉移情況（總體生存期：HR＝2.73，95%CI 1.43～5.22，P＝0.002；無病生存期：HR＝2.34，95%CI 1.54～3.54，P＜0.01）及 Dukes分期（總生存期：HR＝3.15，95%CI 1.36～7.32，P＝0.008；無病生存期：HR＝3.48，95%CI 2.29～5.29，P＜0.01）是結腸癌患者重要的預后影響因素。

3 討論

目前，臨床上應用癌胚抗原、CA125、p16等指標對結腸癌患者手術根治后進行隨訪和評估，已獲得很大收益［4-6］。然而，仍然有許多結腸癌復發病例術后血清學未能檢測出這類基因異常表達，從而未能重視術后及時復查，導致術后死亡率仍然較高。因此，需要挖掘新型的潛在癌相關基因，以評估術后預后［7-9］。本研究應用免疫組化法檢測ZIC5蛋白在結腸癌組織中的表達，結果顯示ZIC5蛋白表達與患者年齡、結腸癌組織學分級、淋巴結轉移情況及Dukes分期呈正相關，高表達者預后不佳。

ZIC5基因表達的ZIC5蛋白具有能與特定DNA結合序列（5′-TGGGTGGTC-3′）特異性結合的結構域，而ZIC5蛋白的這個結構域的作用相當于GLI蛋白，主要在神經系統發育中發揮作用［2］。有研究發現，ZIC5在非小細胞肺癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常組織，且沉默肺癌H1299和H1703細胞株ZIC5后，癌細胞的增殖及侵襲力顯著降低，癌細胞生長停滯在G2期［10］。本研究同樣顯示，ZIC5蛋白在結腸癌組織中的表達明顯高于對應癌旁組織，且主要表達于細胞核。不僅如此，ZIC5蛋白的陽性表達與患者高齡、結腸癌低分化水平、淋巴結轉移及Dukes C期相關，并且其陽性預示著腸癌患者術后5年總體生存期和無病生存期明顯下降，提示對于這類患者，更需要加強術后腸癌復發的監測，以達到早發現、早治療的目的。目前，對ZIC5基因作用機制的相關研究已顯示，沉默ZIC5基因后的瘤體內CCNB1基因表達明顯上調，而Ki67基因表達顯著下降［10］；ZIC5基因有可能通過血小板源性生長因子D介導的FAK和STAT3基因的活化促進黑色素瘤的侵襲與浸潤，這使之有可能成為化療藥物的靶點［11］。然而，國內有研究顯示胃癌組織中ZIC5基因的表達水平與癌旁正常組織無明顯差異，因此對預后評估意義不大［12］。在胃癌中的這一發現與本研究的主要結果并不一致，因此，還需開展進一步的預后調查，ZIC5的作用分子機制也需要深入研究。

綜上，ZIC5蛋白的陽性表達與患者高齡、結腸癌低分化水平、結腸癌淋巴結轉移及Dukes C期密切相關，并且其陽性預示著結腸癌患者術后預后不佳。