高脂飼料聯合鏈脲佐菌素誘導妊娠期糖尿病大鼠模型的優化方案

湯夢雨，徐文婷，王彩紅，王利紅

（張家港市中醫醫院生殖科，江蘇蘇州215600）

妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）指妊娠前糖代謝正常或有潛在的糖耐量減退，妊娠期才出現或發現的糖尿病，是一種常見的妊娠期疾病。目前隨著診斷方式的改進以及產檢的普及，GDM檢出率在不斷增高。國際婦產科聯盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，IFGO）指出，有大約1／6的新生兒是由GDM母親分娩的［1］。研究表明GDM易導致巨大兒、難產和產道損傷，增加剖宮產率，且GDM患者羊水過多的發病率也顯著高于正常女性，從而增加了胎膜早破和早產的發生率［2］。從長遠看來，GDM患者產后發展為2型糖尿病的風險也比正常人高。對于GDM患者的子代，GDM患者孕期宮內高糖，體內代謝的紊亂，在胎兒發育的關鍵時期，持續刺激胎兒并且產生長期影響，這種影響被叫作“代謝記憶”，這種“代謝記憶”效應可使后代在成年后發生2型糖尿病以及肥胖相關的代謝綜合征的概率高于正常人［3］。然而目前尚未對GDM的病因及其對子代不良影響的機制有完善的結論，研究模型局限性較大，因此建立穩定、科學的實驗性GDM動物模型具有重要的意義。本研究探究建立GDM大鼠模型的優化方案，旨在為GDM的研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級6周齡Wistar大鼠90只，其中雌鼠60只，雄鼠30只，體重130～161g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）。40%脂肪飼料（上海普路騰生物科技有限公司），配方為普通繁殖鼠料54.6%、豬油16.9%、蔗糖14%、酪蛋白10.2%、預混料2.1%、麥芽糊精2.2%。

1.2 動物飼養

實驗所用大鼠均飼養于通風良好，溫度控制在22～26℃，相對濕度控制在40%～70%的屏障系統內，標準飲食。定期更換墊料，適應性飼養1周后，改為高脂飼料喂養，飼養8周后禁食不禁水12 h，尾尖取血測血糖，空腹血糖≥6.67 mmol／L者剔除。剔除后剩余大鼠按雌雄2∶1合籠過夜，次日早晨雌鼠陰道涂片鏡檢發現精子記為妊娠第1天，未孕雌鼠繼續與雄鼠合籠，標記孕鼠，記錄孕期。

1.3 分組與造模

所獲42只孕鼠，在高脂飲食基礎上，隨機分為對照組10只以及 STZ不同劑量（15、25、35和45 mg／kg）造模組各8只，禁食12 h后STZ不同劑量組分別一次性腹腔注射不同劑量STZ（用0.1 mmol／L、pH為4.2的枸櫞酸緩沖液配成1%的濃度），對照組注射同等劑量枸櫞酸緩沖液（0.1 mol／L，pH＝4.2）。注射 STZ 3 d后測空腹血糖介于6.67～16.67 mmol／L為 GDM大鼠造模成功［3］。造模完成后繼續原飼料喂養。

1.4 觀察指標

1.4.1 體重 分別于STZ注射后3 d和18 d稱量體重。

1.4.2 空腹血糖 分別于注射STZ前、STZ注射后3 d、7 d及18 d采集尾尖血，血糖儀檢測空腹血糖。

1.4.3 成模率與死亡率 成模率＝各組造模成功孕鼠數量／各組孕鼠總數×100%；死亡率＝各組死亡孕鼠數量／各組孕鼠總數×100%。

1.4.4 孕鼠及仔鼠的一般情況 記錄子鼠數量及體重。

1.4.5 組織HE染色 孕鼠25周齡處死，HE染色觀察正常孕鼠及成模孕鼠肝臟組織、胰腺及脂肪細胞的變化。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 孕鼠體重的變化

各組孕鼠造模前體重差異無統計學意義。注射STZ后18 d，15 mg／kg組孕鼠體重與對照組差異無統計學意義，25、35、45 mg／kg組與對照組比較均明顯減輕（均 P＜0.01）。見表1。

2.2 孕鼠空腹血糖的變化

注射STZ前各組大鼠空腹血糖水平無明顯差異。對照組造模后3 d、7 d、18 d血糖與造模前相比差異無統計學意義。15 mg／kg組造模后3 d、7 d、18 d血糖與對照組相比差異無統計學意義。25 mg／kg組注射STZ 3 d、7 d、18 d后血糖與對照組相比均明顯升高（P＜0.05）。注射 STZ 3 d后45 mg／kg組的空腹血糖均高于20mmol／L，注射STZ 7 d后35 mg／kg組的平均空腹血糖高于16.67 mmol／L，兩組血糖均高于6.67～16.67 mmol／L的成模標準。見表2。

表1 注射STZ前后孕鼠體重的變化±s，g

表1 注射STZ前后孕鼠體重的變化±s，g

*：P＜0.01，與對照組比較

對照組10 263.7±9.5 10 317.8±28.9 54.1±9.6 STZ 15 mg／kg 8 266.8±9.0 8 303.8±9.1 37.0±4.9 25 mg／kg 8 265.9±7.9 7 293.1±7.6* 27.3±2.0 35 mg／kg 8 266.5±8.4 6 275.5±13.0* 9.0±7.1 45 mg／kg 8 263.7±15.0 3 203.0±7.2* -60.7±8.5 F值0.212 25.576 P值 ＞0.05 ＜0.01

表2 注射STZ前后孕鼠空腹血糖的變化±s，mmol／L

表2 注射STZ前后孕鼠空腹血糖的變化±s，mmol／L

*：P＜0.05，與對應天數的對照組比較

對照組 10 4.31±0.29 10 4.19±0.52 4.71±0.30 4.80±0.50 0.656 ＞0.05 STZ 15 mg／kg 8 4.09±0.51 8 4.84±0.83 5.38±1.94 4.59±0.78 1.730 ＞0.05 25 mg／kg 8 3.90±0.69 7 7.07±0.90*9.67±4.53*6.86±2.50* 6.125 ＜0.05 35 mg／kg 8 4.36±0.38 6 13.94±5.72*18.40±4.00*14.32±3.03*18.897 ＜0.01 45 mg／kg 8 4.50±0.35 3 22.37±3.65*29.70±0.52*26.57±1.46*269.777 ＜0.01 F值0.685 42.425 65.180 111.245 P值0.607 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01

2.3 各組的成模率及死亡率

15 mg／kg組未出現孕鼠死亡但成模率僅為12.5%，25 mg／kg組 成 模 率 最 高 且 死 亡 率 為12.5%，35 mg／kg及45 mg／kg組成模率低且死亡率均較高。見表3。

表3 成模率與死亡率

2.4 孕鼠及仔鼠一般情況

25、35及45 mg／kg組均出現了明顯的“三多一少”糖尿病癥狀，45 mg／kg組62.5%的孕鼠死亡，并且所產仔鼠膚色呈暗紫色，活動力較差。35及45 mg／kg組所產仔鼠數量較其余3組明顯減少且出現死胎、流產和巨大胎等異常發育情況。見表4。

2.5 各組大鼠肝臟、胰腺組織及脂肪細胞的變化

HE染色結果顯示，成模組肝臟出現肝細胞輕度至中度脂肪變性，并伴有輕度局灶炎細胞浸潤，偶見個別肝細胞變性壞死。成模組的胰腺胰島輕度至中度萎縮，外泌腺腺泡輕度變性萎縮并伴有輕度炎細胞浸潤及胰島細胞輕度變性。成模組脂肪細胞體積輕度增大。見圖1。

表4 各組所產子鼠情況

圖1 大鼠肝臟、胰腺和脂肪組織病理形態（HE染色×200）

3 討論

目前對實驗型GDM大鼠模型標準的判定尚不統一，有研究使用大劑量STZ注射使模型的空腹血糖普遍高于16.67 mmol／L，但成模后導致孕鼠的死亡率、流產率、子代低體重、畸形率增高且血胰島素水平下降［4-7］，與人類GDM的表現不符。所以本次研究選用輕度糖尿病的標準（6.67～16.67 mmol／L）作為成模標準，有利于觀察GDM對母體及子代的長期影響［8］。

本次研究通過觀察注射STZ前后體重及血糖的波動情況來確定最穩定的造模方式，因大鼠的妊娠期一般在21 d左右，故本次研究觀察妊娠后期注射第18天的血糖及體重變化判斷造模的穩定性。結果顯示25 mg／kg劑量的STZ聯合8周高脂飼料喂養的造模方式不僅能使血糖維持在6.67～16.67 mmol／L的輕度糖尿病水平，且成模率高，死亡率較低。而低劑量（15 mg／kg）的STZ注射組成模率過低。高劑量組（35 mg／kg、45 mg／kg）的孕鼠空腹血糖水平較高，成模率較低，并且死亡率高。HE染色顯示，成模孕鼠肝臟出現肝細胞輕度至中度脂肪變性及局灶炎細胞浸潤等改變，胰腺胰島出現輕度至中度萎縮及外泌腺腺泡輕度變性萎縮等變化，脂肪細胞則出現了輕度體積增大。此次研究我們發現，適當的長時間高脂飼料喂養聯合中等劑量STZ的注射不僅可以減少大劑量藥物注射對大鼠機體的損害以及避免高死亡率，還可以降低血糖波動幅度，使模型穩定在較高的血糖水平，從而得到較穩定的GDM大鼠模型。

STZ是目前應用于誘導糖尿病動物模型的常用藥物之一，其機制是特異性地破壞胰島β細胞，引起胰島素分泌功能障礙［9］。單純使用STZ造模，血糖不易控制，與臨床實際不符。研究顯示，高脂可通過引起外周組織的胰島素抵抗和胰腺β細胞合成以及分泌胰島素的功能減退甚至衰竭，從而導致失代償引起血糖升高［10］。高脂飼養與人類臨床GDM的發病機制類似，但存在周期長、成模率低、個體差異大的缺陷。故本研究采用高脂飲食聯合STZ注射的方法，不僅避免了單純高脂飼養造模需要較長時間周期的成本，同時也可減少單純大劑量STZ注射的不良影響。

GDM不僅會影響婦女，更會對其子代造成不利影響。高血糖與不良妊娠結局（Hyperglycemia and Adverse Pregnancy Outcome，HAPO）研究結果提出，隨著婦女妊娠期血糖水平的升高，其發生早產、子癇前期、臍血C肽水平升高、新生兒低血糖、新生兒高膽紅素血癥、新生兒入ICU等的風險也隨之升高。這種相關呈連續性，即使妊娠期血糖輕度升高，同樣會對妊娠結局產生不利影響［11］。綜上，本研究結果表明高脂飲食聯合中等劑量STZ誘導GDM大鼠模型，造模成功率高、死亡率低。