解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌的抑制作用

李 揚，張朝紅，于秋香，李 杰，張獻輝

（1.河北省農林科學院昌黎果樹研究所，河北 昌黎 066600；2.新疆農墾科學院林園研究所，新疆 石河子 832000）

棗黑斑病最早于1985年發現[1]，1996年在山西棗區暴發流行[2]，近年來在新疆、云南、山東、河北和河南等地普遍發生[3，4]，給當地棗農及棗產業發展造成了重大損失。目前，棗黑斑病的防治以噴施化學藥劑為主，而連年施用化學農藥易產生抗藥性、發生藥物殘留等問題[3，5]。

減少或避免使用化學農藥，減輕環境污染，保障食品安全和發展有機農業是我國現代農業發展的重要方向[5，6]。生物防治是通過植物、病原物、生防菌、植物表面及其周圍微生物群落和自然環境等因素的相互作用，達到防治病害的目的。自1914年開始，生物防治受到關注，現已成為植保研究的熱點之一。采用拮抗微生物來防治植物病害是植物病害防控的一個重要手段[7]。以前期篩選的拮抗菌——解淀粉芽孢桿菌ZJ01為試材，研究其對棗黑斑病菌的抑制效果，以期為棗黑斑病的生物防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：解淀粉芽孢桿菌ZJ01（序列號HQ910433），由河北農業大學中國棗研究中心提供，從健康棗葉片中分離獲得[8]；棗黑斑病菌LG（LG），由塔里木大學植物科學學院提供。

PDA培養基：馬鈴薯200 g、瓊脂14 g、葡萄糖20 g和蒸餾水1 L。NB培養液：蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、牛肉膏3 g/L和蒸餾水1 L。培養基和培養液的配制參照方中達的《植病研究方法》[9]，制作完成后在蒸汽高溫滅菌鍋內121℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌菌落生長的抑制作用 將LG于25℃條件下在PDA培養基上培養，3～6 d后在菌落邊緣打取直徑6 mm的菌餅，接種于已滅菌的PDA培養基中心（培養皿直徑10 cm）。將解淀粉芽孢桿菌ZJ01于25℃條件下在PDA培養基上劃線培養，2～3 d后在菌落中央打取直徑6 mm的菌餅，接種于LG兩側2 cm處；以未接種解淀粉芽孢桿菌ZJ01的LG培養基作為對照。5次重復。于25℃條件下培養8 d后，測量菌落半徑以及趨向半徑，計算被抑制率〔%，（對照菌落半徑-處理菌落半徑）/對照菌落半徑×100%〕。同時，挑取對照和對峙區域帶菌落的培養基，在顯微鏡下觀察LG菌落菌絲的形態變化。

1.2.2 解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌孢子萌發的抑制作用 將LG于25℃條件下在PDA培養基上培養7 d后，加入5 mL無菌水沖洗，用移液槍吸取沖洗液后用事先已經滅菌的紗布過濾得到LG孢子懸浮液，濃度達1×107個/mL。

將解淀粉芽孢桿菌ZJ01接種于NB培養液中，于28℃搖床上振蕩培養48 h，獲得解淀粉芽孢桿菌ZJ01發酵液。將解淀粉芽孢桿菌ZJ01發酵液在4℃、10 000 r/min條件下離心15 min，取其上清液，經細菌過濾器抽濾后得到含有解淀粉芽孢桿菌ZJ01代謝產物的無菌發酵原液；然后，分別稀釋0倍、2倍、4倍和8倍，得到4種不同濃度的無菌發酵液。

吸取NB無菌培養液（CK）和4種不同濃度的解淀粉芽孢桿菌ZJ01無菌發酵液各40 μL，分別滴入載玻片的凹槽中，晾干后再分別滴入40 μL的LG孢子懸浮液，3次重復。于25℃條件下保濕培養24 h后，在顯微鏡下觀察孢子的萌發情況[10]。

2 結果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌LG菌落生長的抑制作用

2.1.1 對菌落生長的抑制 解淀粉芽孢桿菌ZJ01與棗黑斑病菌LG平板對峙培養4 d時，LG菌落出現抑制區域；培養至8 d時，抑制區域較為明顯，LG的被抑制率達到53.3%（圖1）。

圖1 解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌LG菌落生長的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of B.amyloliquefuciens ZJ01 on the colony of A.alternata LG

2.1.2 對菌絲生長的抑制 培養8 d后，對照培養的棗黑斑病菌LG菌絲依然平滑，沒有出現異常變化（圖2-A、2-B）；對峙區的棗黑斑病菌LG菌絲生長受到明顯抑制，表現為菌絲頂端膨大（圖2-C、2-D）、異常產孢（圖2-D、2-E），原生質發生割裂（圖2-F）等。

圖2 解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌LG菌絲形態的影響Fig.2 Effect of B.amyloliquefuciens ZJ01 on the shape of A.alternata LG mycelium

2.2 解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌LG孢子萌發的抑制作用

通過顯微鏡觀察凹面載玻片上棗黑斑病菌LG孢子的萌發情況發現，解淀粉芽孢桿菌ZJ01的代謝物對棗黑斑病菌LG孢子萌發具有明顯的抑制作用（圖3）。其中，CK處理的棗黑斑病菌LG孢子萌發產生了大量的網狀菌絲（圖3-A）；而解淀粉芽孢桿菌ZJ01無菌發酵液處理的棗黑斑病菌LG孢子仍清晰可見，且多數孢子上產生了圓形小泡，僅有少量孢子產生了萌發管，且萌發管長度與孢子大小相當（圖3-B~E）。說明解淀粉芽孢桿菌ZJ01的代謝物抑制了棗黑斑病菌LG的孢子萌發及菌絲生長。

圖3 解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌LG孢子萌發的影響Fig.3 Effect of B.amyloliquefuciens ZJ01 on the spores germination of A.alternata LG

3 結論與討論

芽孢桿菌對病原菌形態產生的影響包括菌絲破裂[11]、壞死、液泡狀膨大、過度膨大等[12]。本研究結果表明，解淀粉芽孢桿菌ZJ01會誘導棗黑斑病菌LG菌絲過度膨大、產生割裂形態和異常產孢。從形態上明確了解淀粉芽孢桿菌ZJ01對棗黑斑病菌的抑制作用。對于異常產孢后，其孢子的生活力如何、能否正常萌發還有待進一步研究。

自然條件下棗黑斑病以鏈格孢菌孢子的形式侵染，因此，解淀粉芽孢桿菌ZJ01抑制棗黑斑病菌孢子萌發就成為防控棗黑斑病的關鍵之一。通過對解淀粉芽孢桿菌ZJ01無菌發酵液與棗黑斑病菌LG進行玻片對峙培養發現，解淀粉芽孢桿菌ZJ01的代謝產物能明顯抑制棗黑斑病菌LG孢子的萌發。今后，對于解淀粉芽孢桿菌無菌發酵液抑菌的最佳使用濃度還有待進一步研究。