轉基因甜菜H7-1品系LAMP現場快速檢測方法的建立

諶鴻超，蔣 靜，鄭 江，樊彥莉，張舒亞，楊捷琳

(上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135)

甜菜是重要的糖料作物，榨糖后的甜菜粕是重要的動物飼料。隨著轉基因技術的發展，轉基因甜菜種植及應用日益廣泛。自2006年轉基因甜菜被美國批準商業化種植以來，轉基因甜菜在美國和加拿大被廣泛種植，2011年轉基因甜菜占美國甜菜種植面積的95%，2014年為98.5%，2015—2016年為100%。2016年加拿大甜菜種植也均為轉基因甜菜，并被批準用于食用和飼用[1]。目前，商業化種植的轉基因甜菜有3個品系，分別為轉基因甜菜H7-1(抗草甘膦)、轉基因甜菜GTS B77(抗草甘膦)和轉基因甜菜T120-7(抗草銨膦)，均為抗除草劑。目前大面積種植的是抗草甘膦甜菜H7-1品系，是Monsanto公司產品，轉入的外源基因主要有FMV35s、E9 3’、cp4epsps和ctp2[2]。

目前對于轉基因生物安全性還有爭議，歐盟、日本、中國出臺了轉基因產品標簽法規，對轉基因產品實施標識。根據我國農業部發布的《進口用作加工原料的農業轉基因生物審批情況》，我國僅批準了轉基因甜菜H7-1品系用作加工原料，該品系的進口有效期截止到2018年5月8日[3]。質檢總局在2016年發布《進口美國甜菜粕檢驗檢疫要求的公告》(2016年第97號)，自2016年9月起允許美國甜菜粕進口[4]。根據法規及相關進出口要求，張舒亞等[2]建立了轉基因甜菜H7-1的實時熒光PCR檢測方法，也建立了轉基因甜菜H7-1的PCR檢測方法標準[2,5]。PCR方法由于具有高特異性、高靈敏度被廣泛應用，然而該方法需配置高精尖儀器，技術要求較高，不適用于現場快速檢測。目前口岸一線和企業自控需要有簡便快速、不需精密儀器和專業人員的現場快速檢測方法。

環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術是近年來發展的一種新穎的和較成熟的等溫核酸擴增技術。與PCR方法相比，LAMP不需要熱循環儀(PCR儀)，且LAMP反應中產生大量的副產物——白色焦磷酸鎂沉淀，擴增產物通過肉眼觀察或濁度計即可判定結果。該方法操作簡單，易于推廣，對設備和檢測人員要求較低，更適用于口岸簡易實驗室和進出口企業，可實現快速、準確的檢測，該技術并已在核酸的科學研究、病原微生物鑒定等領域得到了廣泛應用[6-9]。本研究擬將LAMP技術應用于轉基因甜菜H7-1的檢測，以期建立轉基因甜菜H7-1的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試劑：Bst DNA polymerase large fragment，New England Biolabs公司；甜菜堿(Betaine)、MgCl2，Sigma公司；dNTPs，寶生物工程(大連)有限公司；SYBR Green I 熒光染料，Invitrogen公司；E.Z.N.A.? HP Plant DNA Kit，OMEGA公司；引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。轉基因甜菜H7-1樣品、其他植物樣品及加工產品為實驗室保留樣品。

儀器：離心機；漩渦混合器；LAMP實時濁度儀；LA-320C，日本榮研化學株式會社；BioPhotometer plus核酸蛋白含量測定儀，德國Eppendorf公司。

1.2 引物設計

根據轉基因甜菜H7-1品系外源基因和甜菜邊界序列設計一套特異性引物，包括：

上游外引物(F3)：AACACTTAGCTTGGGACAA；

下游外引物(B3)：TGATTGAACCCAATCTGGA；

上游內引物(FIP)：CCGTAATGAGAAGAGAGAAACATCATATTTCTTAATTTTTGCAGGCGA；

下游內引物(BIP)：TCTGGGTGGCTCTAACTATTTACATTTT-CTCAAGCTTGATGGGGAT；

上游環引物(LF)：AACACAAAATGCTCATAACAGCCAC；

下游環引物(LB)：CTGAAGGCGGGAAACGACAA。

外引物擴增片段長度為237 bp。

1.3 樣品制備及DNA提取

取100%轉基因甜菜和0%轉基因甜菜標準品(購買自IRMM)，按質量比將上述兩種樣品混合成轉基因成分質量分數為5%、1%、0.5%的待測樣品。

樣品DNA的提取使用E.Z.N.A.?HP Plant DNA Kit，-20℃儲存備用。

1.4 體系建立和引物篩選

初步確定25 μL的LAMP反應體系：FIP和BIP各1.6 μmolL，F3和B3各0.2 μmolL，LF和LB各0.8 μmolL，20 mmolL Tris-HCl(pH 8.8)，10 mmolL KCl，8 mmolL MgSO4，10 mmolL (NH4)2SO4，0.1% Tween20，1 molL甜菜堿，6 mmolL MgSO4，1.6 mmolL dNTP，8 U Bst大片斷DNA聚合酶，2 μL DNA引物。用100%轉基因甜菜H7-1標準品作為模板進行引物的初步篩選，同時以無菌水作為陰性對照。使用LAMP濁度儀觀察，63℃恒溫反應60 min，最后80℃下保溫5min結束反應，根據出峰時間及陰陽性符合率初步篩選引物。

1.5 特異性試驗

選擇24個植物轉基因品系，分別為：轉基因甜菜H7-1(A1)、GM棉花MON531(A2)、GM大豆GTS40-3-2 (A3)、GM大米Bt63 (A4)、GM油菜MS8×RF3(A5)、轉基因玉米GA21(A6)、轉基因玉米MON810 (A7)、轉基因玉米MM88(A8)、轉基因玉米MON863(B1)、轉基因玉米MON88017(B2)、轉基因玉米NK603(B3)、轉基因玉米MIR604(B4)、轉基因玉米MON89034(B5)、轉基因玉米CBH351(B6)、轉基因玉米BT11(B7)、轉基因玉米BT176(B8)、轉基因玉米EVENT98140(C1)、轉基因土豆EH92-527-1(C2)、轉基因大豆DP305423(C3)、轉基因大豆DP356043(C4)、轉基因大豆GTS40-3-2(C5)、轉基因水稻‘科豐6號’(C6)、轉基因水稻‘科豐8號’(C7)、轉基因油菜GT73(C8)。

使用上述建立的LAMP反應體系進行試驗，評估其特異性，使用LAMP濁度儀觀察結果。

1.6 靈敏性試驗

使用建立的LAMP反應體系對轉基因甜菜H7-1品系成分質量分數為0%、0.1%、0.5%、1%的樣品進行檢測，評估其靈敏度。

1.7 穩定性試驗

分別對4個不同質量分數(空白樣品0%、添加水平0.5%、1%、5%)的轉基因甜菜H7-1樣品進行檢測，每個樣品重復20次，評估方法的穩定性。

1.8 一致性試驗

為驗證方法的準確性，選取36份樣品作為待測樣品，包括非轉基因甜菜、其他植物樣品及加工產品、非目的轉基因成分的其他轉基因樣品，轉基因甜菜H7-1及含轉基因甜菜H7-1成分的植物模擬樣品及加工產品。使用建立的轉基因甜菜H7-1實時濁度LAMP檢測和顯色法LAMP檢測，并使用歐盟發布的官方檢測方法熒光PCR法進行驗證，比較檢測結果與熒光PCR方法結果的一致性。

CH1—2：陰性對照(非轉基因甜菜)；CH3—4：陽性對照(轉基因甜菜H7-1)圖1 轉基因甜菜H7-1品系引物LAMP篩選結果Fig.1 LAMP screening results of primers for genetically modified sugar beet H7-1

2 結果與分析

2.1 引物篩選和體系優化

結果顯示，設計的LAMP引物具有較好的特異性，轉基因甜菜H7-1標準品具有明顯擴增，而陰性對照未出現擴增(圖1)。在引入環引物后，縮短了反應時間，初步確認后續試驗反應時間為60 min。

2.2 LAMP檢測方法的特異性試驗

對24個植物轉基因品系進行LAMP反應體系特異性驗證，除轉基因甜菜H7-1品系(A1)出現擴增外，其余樣品均未出現擴增(圖2)，表明該方法具有特異性。

圖2 轉基因甜菜H7-1品系LAMP特異性檢測Fig.2 Specificity detection of genetically modified sugar beet H7-1 by LAMP

D1：陽性對照；D2：5%轉基因甜菜H7-1；D3：1%轉基因甜菜H7-1；D4：0.5%轉基因甜菜H7-1；D5：0.1%轉基因甜菜H7-1；D6：0%轉基因甜菜H7-1圖3 轉基因甜菜H7-1品系的實時濁度LAMP檢測靈敏度Fig.3 Sensitivity detection of genetically modified sugar beet H7-1 by real-time turbidity LAMP

2.3 LAMP檢測方法的靈敏性試驗

實時濁度LAMP檢測結果顯示：質量分數5%、1%和0.5%的轉基因甜菜H7-1樣品均出現擴增，0.1%和0%轉基因甜菜H7-1樣品未出現擴增，表明該方法體系的檢測下限為0.5%(圖3)。顯色法LAMP結果顯示：質量分數1%、0.5%的轉基因甜菜LAMP反應呈現綠色，檢測為陽性；0%、0.1%轉基因甜菜樣品LAMP反應呈黃色，檢測為陰性(圖4)。由此可見，顯色法LAMP可以檢測出轉基因質量分數低至0.5%的轉基因甜菜H7-1品系。

2.4 LAMP檢測方法的穩定性試驗

對質量分數5%、1%、0.5%和0%的轉基因甜菜H7-1樣品進行LAMP檢測，并重復20次。結果顯示，質量分數5%、1%和0.5%的轉基因甜菜H7-1反應呈綠色，0%轉基因甜菜H7-1反應呈黃色，LAMP檢測準確率達到100%(圖5)，表明該方法檢測甜菜中甜菜H7-1品系轉基因成分穩定性較好。

2.5 LAMP檢測方法與實時熒光PCR檢測方法的一致性試驗

結果顯示，兩種方法對于特異性檢測結果一致。本研究建立的轉基因甜菜H7-1實時濁度LAMP檢測和顯色法LAMP檢測，對質量分數0.5%的轉基因甜菜H7-1能特異性擴增，而低于0.1%的轉基因甜菜H7-1及其他非目的基因轉基因產品不出現擴增，而實時熒光PCR方法能檢出質量分數0.1%的轉基因甜菜H7-1樣品(表1)。

(續表1)

3 討論

轉基因甜菜H7-1品系在美國和加拿大分別于2006年和2008年被批準種植，并已在美國、加拿大、澳大利亞、哥倫比亞、智利、中國等國被批準食用和(或)飼用，但轉基因食品的安全性問題一直備受爭議。歐盟、日本、加拿大、澳大利亞、中國等實施了轉基因食品標識法規。為應對相關法規要求，我國建立了相關轉基因成分檢測方法標準。對轉基因成分的檢測標準，基本上是基于蛋白質的ELISA檢測方法和基于基因的PCR檢測方法，這需要使用較專業和昂貴的檢測設備,并需要專業人員操作。隨著技術的發展以及企業和一線對于現場快速檢測的要求等，目前急需要現場能快速和便捷檢測的技術和方法。本試驗利用LAMP技術建立轉基因甜菜H7-1品系的快速檢測方法，通過體系優化，對該方法的特異性、敏感性、穩定性進行了驗證，結果表明建立的轉基因甜菜H7-1的LAMP檢測方法特異性強，穩定性好，靈敏度高，可檢出轉基因含量高于質量分數0.5%的轉基因甜菜H7-1品系；通過對特定樣品的檢測，檢測結果與歐盟規定的熒光PCR方法結果一致，可用于轉基因甜菜H7-1的快速檢測，能夠滿足法規要求，建立的檢測方法可適用于口岸一線檢驗檢疫需要以及企業的自控檢測要求。然而，目前建立的LAMP檢測方法只能用于定性檢測，不能定量，使用LAMP檢測技術進行定量檢測需要進一步研究。