肺炎鏈球菌的培養及常規鑒定

王欣

【摘 要】目的：本實驗選用肺炎鏈球菌為研究目標，為基礎研究提供相對應的方法參考。方法：簡述肺炎鏈球菌的復蘇，傳代，凍存的方法，繪制肺炎鏈球菌生長曲線，通過革蘭氏染色和奧普托欣（ Optochin）實驗對菌種進行鑒定。結果：經不同時間段對菌液進行計數發現，16h左右為菌液最大濃度期，Optochin實驗抑菌環為22.3mm±2.1mm。結論：可根據本論文的實驗步驟進行基礎研究，結果可進行參考。

【關鍵詞】肺炎鏈球菌；生長曲線；鑒定方法

【中圖分類號】R365 【文獻標志碼】B 【文章編號】1005-0019（2018）10-222-01

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）屬于革蘭氏陽性菌，菌落類似圓球狀，并持有α溶血環。其廣泛分布于自然界中，為條件致病菌，是呼吸道感染的常見病原菌之一[1]。作為引起慢性支氣管炎急性發作和社區獲得性肺炎的主要病原菌[2]，肺炎鏈球菌一直是眾學者研究的熱點。現對其特性及生長曲線進行研究，為基礎研究提供參考。

1 實驗材料及相關儀器

1.1 實驗菌種 肺炎鏈球菌菌種（購買于中國工業微生物菌種保藏管理中心，CICC編號：10913）

1.2 藥物與試劑 血平皿：鄭州人福博賽生物技術有限公司，批號 150928-2；奧撲托新（Optochin）藥敏片：5μg，6.35mm，20片，康泰生物，批號0C05；牛肉粉：北京奧勃星生物技術有限公司，批號12012； 氯化鈉：天津市風船化學試劑科技有限公司，批號20140510；蛋白胨：北京奧勃星生物技術有限公司，批號11001；草酸銨：天津市致遠化學試劑有限公司，批號140410；結晶紫：天津市致遠化學試劑有限公司，批號141002；蕃紅液：天津市致遠化學試劑有限公司，批號150503；胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司，批號121112。

1.4 主要儀器 SorvaⅡ ST16低溫離心機（Thermo公司），4-1生物顯微鏡（OLYMPUS 日本）；BHC-1300ⅡA/B3型生物潔凈安全柜（蘇州凈化設備有限公司）；MDF-382E -80℃低溫冰箱（日本三洋公司）。

2 實驗方法及結果

2.1 實驗試劑的配置 肺炎鏈球菌液體培養基的配制：

蛋白胨：1.0g；牛肉膏：0.3g；氯化鈉：0.5g，以上粉末充分溶于95ml無菌水中，混勻后將PH值調至7.2-7.4左右，高壓滅菌后冷卻。冷卻后的培養基與胎牛血清按：胎牛血清：5ml，培養基95ml比例混合，4℃保存備用。

2.2 實驗內容

2.2.1 肺炎鏈球菌的復蘇及培養 凍干粉：生物安全柜紫外消毒30min，取出肺炎鏈球菌菌種凍干粉，用0.5ml滅菌雙蒸水稀釋干粉，接種于兩個血平板上，每個0.25ml，用接種環均勻涂抹整板即可。37℃恒溫培養箱中常規培養

凍存管：從-80℃冰箱或液氮中取出菌種后，37℃水浴鍋快速溶解后，無菌生物安全柜內取0.25ml內用接種環均勻涂抹整板即可。37℃恒溫培養箱中常規培養。

2.2.2 肺炎鏈球菌的傳代及凍存 傳代：接種環取出培養成熟的一環菌，用三區劃線法傳代于血平板上。培養成熟的菌可放于4℃冰箱備用，但時間不可超過3天。

凍存：將活化3代的菌接種于液體培養基中，培養后4℃，6000轉離心，棄上清，用甘油與胎牛血清比例為2：8的1ml混合液體混勻沉淀，儲存于無菌凍存管中，凍存于-80℃冰箱或液氮。

2.2.3 肺炎鏈球菌CFU計數 即平板計數法。將菌液樣品用無菌生理鹽水進行10倍稀釋，取合適的稀釋度（一般5個稀釋度），以涂布法接種于平板進行操作，常選取菌落數為30-300之間的平板作為菌落計數標準，每一稀釋度采用三個平板菌數的平均數，經培養后，按照計數標準規定，統計平板上的菌落，即

菌落濃度（cfu/ml）=3平板菌落計數平均值×10n（n=稀釋倍數）

2.2.4 肺炎鏈球菌生長曲線的繪制 根據肺炎鏈球菌自溶特性，取1環菌培養在5ml培養基中，在不同時間點的進行菌落計數，做出生長曲線，結果見圖1。

由圖1及表1可見，肺炎鏈球菌在培養到16h-18h時左右時，菌量達到峰值，而后逐漸下降，在以下實驗中均選擇培養時間為16-18小時左右。

2.3 肺炎鏈球菌菌種的鑒定

2.3.1 形態學觀察 菌落：灰色，半透明，光滑，扁平小菌落，培養20h以后周圍可見草綠色溶血環。

2.3.2 革蘭染色法 革蘭染色[3]：

涂片：用接種環從菌液中取出一環菌于載玻片中央涂成薄層即可，或先滴一滴無菌水于載玻片中央，用接種環從平板上挑出少許，與載玻片上的水滴混合均勻，涂成一薄層；干燥：涂片后在室溫下自然干燥；固定：手持載玻片一端，標本面朝上，在燈的火焰外側快速移動3-4次，共約3-4秒，要求玻片溫度不超過60℃，以玻片背面觸及手背皮膚不覺過燙為宜，放置待冷后染色；

染色：①初染：加草酸銨結晶紫一滴，約1分鐘水洗；②媒染：滴加碘液，沖去殘水，并覆蓋約1分鐘；③脫色：將載玻片水甩凈，并襯以白背景，用95%酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現紫色時為止，約20-30秒，立即用水沖凈酒精；④復染：用蕃紅液染1-2分鐘水洗鏡檢：干燥后，置油鏡觀察，革蘭氏陽性菌呈紫色

2.3.3 COptochin敏感試驗 幾乎所有的肺炎鏈球菌對奧普托欣敏感，而其他鏈球菌耐藥。

4 討論

肺炎鏈球菌感染是由肺炎鏈球菌入侵機體而引發的感染性疾病，包括肺炎、敗血癥、腦膜炎及中耳炎等[4]。肺炎鏈球菌作為常見致病菌，可引起多種疾病，因此大量的研究人員進行相關疾病的基礎及臨床研究。關于如何培養，在文獻中有大量相關報道，但大多一筆帶過，在實驗的細節處往往不知所措。本論文作者在實驗中總結經驗分享給大家，希望對相關基礎研究提供參考。

參考文獻

[1] Cloutier MM， loughl ia GM.Chronic cough in children： A manif-estation of Airway hyperreactivity[J].1981， 67（1）： 6-12.

[2] 康悅，吳菊芳，黃海輝等.肺炎鏈球菌引起的社區獲得性肺炎及慢支急性加重患者的臨床特性分析[J].中國感染與化療雜志2011青年優秀論文集，2011：207-210.

[3] 陳秀榮.革蘭染色實驗教學體會[J].中國西部科技，2014，9：115.