抗結核骨組織工程復合體局部治療兔脊柱結核的對比研究

王騰飛，麥麥提艾力·阿不力克木，楊勇，陳江濤，王翀，陶穎，宋興華

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院骨科中心，新疆 烏魯木齊 830054)

結核病是感染性疾病中的頭號殺手，且在全球范圍內呈逐年上升趨勢，我國結核病疫情尤為嚴重[1]。尤其是感染艾滋病病毒的患者越來越多，增加了此類患者患有結核病的可能。脊柱結核是常見的肺外結核，約占結核患者的9%～12%[2-3]。對于脊柱結核的治療，化療是首選[4]。但骨結核血液供應差，口服藥很難到達病灶，且8%～12%的患者具有一線抗結核藥物耐藥性。骨結核最常用的治療方法是外科手術清除病灶。而結核病灶清除后，需要在椎體缺損區(qū)域進行植骨填補以支撐脊柱，否則會造成椎體塌陷，植骨能一定程度上維持脊柱的力學穩(wěn)定性。雖然自體骨移植是骨修復技術的“金標準”[5]。但自體骨來源有限，易出現(xiàn)取骨區(qū)感染、疼痛等癥狀。而且同種異體骨有免疫排斥、愈合緩慢、感染等特點。因此研發(fā)新型骨缺塤修復材料迫在眉睫。隨著組織工程的快速發(fā)展，人工骨作為一種良好的骨替代材料，越來越被大家所認可[4]。羥基磷灰石與/β-磷酸三鈣(hydroxyapatite and/β-tricalcium phosphate，HA/β-TCP)構成的復合材料是目前廣泛應用于臨床的人工復合材料。HA/β-TCA與脂肪干細胞的復合可以更好地誘導骨細胞生長，促進骨組織的生成，而且具有良好的孔隙率，有利于種子細胞與材料復合，是骨組織工程中比較理想的生物復合材料[6]。結核術后患者仍然需要長周期服用抗結核藥物，由于副作用較大，患者依從性差，使得全身用藥的臨床療效受到限制。因此，提高脊柱結核局部病變血藥濃度，增強滅菌能力，而且能在病灶局部形成有效的藥物濃度，尋找一種新的替代給藥途徑就顯得尤為重要[7]。緩控釋制劑可以長期緩釋藥物，控制藥物劑量，減少給藥次數(shù)，提高患者順應性，受到廣大醫(yī)務工作者及患者的青睞。本實驗采用利福噴丁微球作為包封藥物，采用降解可控的高分子生物材料HA/β-TC作為載體，與脂肪干細胞構成抗結核性骨組織工程復合體，我們希望將緩控釋微球的優(yōu)點和新型植骨材料的特點結合起來，研發(fā)一種既能滿足局部長效釋藥，又能提供一定力學強度、促進骨融合的新型輔助抗結核治療的植骨材料。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及場所 成年健康新西蘭大白兔72只，雌雄不限，體重(3.0±0.3)kg，由新疆疾病防控中心提供。實驗場地為新疆自治區(qū)動物試驗中心，飼養(yǎng)溫度及濕度適中。動物實驗倫理審批號：IACUC-20130217048。

1.2 實驗儀器 超凈工作臺(賽默飛世爾科技公司)、CO2培養(yǎng)箱(力新HF240)、水浴箱(上海精密設備)、UV2550紫外可見分光光度計(日本島津)、酶標儀(Thermo)、流式細胞儀(Beckman)，倒置顯微鏡、共聚焦熒光顯微鏡(Leica)、電鏡(上海菁華科技儀器有限公司)、獸醫(yī)用X線攝影(天地智慧ELITE 2000 Plus型)。Ingenia1.5T全數(shù)字磁共振成像儀(荷蘭Philips公司)。

1.3 實驗試劑 低糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液PBS(HyClone)、Ⅰ型膠原酶(Worthington)、胰蛋白酶R溶液、青一鏈霉素(Gibco)、地塞米松、抗壞血酸、維生素C、β-甘油磷酸鈉、茜紅素染液、ALP檢測試劑盒、ALP染液(Sigma)、人工骨粒復合體(HA/β-TCP，Bi-Ostetic)(復合體是有60%的羥基磷灰石和40%的β-磷酸三鈣組成)。利福噴丁微球(已申請國家專利)，聚乳酸由山東醫(yī)療器械公司提供(試劑級，分子量3萬)，二氯甲烷、甲醇等試劑，細胞凋亡試劑盒(BD)均購自市售，結核桿菌由新疆畜牧科學院提供。

2 實驗方法

2.1 兔脂肪干細胞的提取、培養(yǎng)及體外成骨誘導分化 選取新西蘭大白兔2只，耳緣靜脈采用3%戊巴比妥鈉(1～2 mg/kg)麻醉，在無菌手術臺下取腹股溝區(qū)脂肪組織，分離大體可見的筋膜、血管，用眼科剪剪碎，放入含有20 mL PBS管離心、震蕩消化，終止消化后加入低糖DMEM完全生長液，隔天更換培養(yǎng)基，細胞達90%融合時進行傳代。將細胞擴增至第3代、細胞貼壁生長達90%融合時加入成骨誘導培養(yǎng)液誘導培養(yǎng)，每3天更換1次培養(yǎng)液，4周后進行茜素紅染色。

2.2 抗結核性骨組織工程復合體的構建

2.2.1 制備同種異體部分脫鈣骨支架 取處死的新西蘭大白兔雙側髂骨，剔除表面脂層、肌層、筋膜、骨膜等，經(jīng)蒸餾水、1︰1的氯仿/甲醇、0.5%鹽酸充分沖洗。經(jīng)脫脂、脫鈣、脫蛋白后，修剪成約5 mm×5 mm×2 mm大小。于-20℃冷藏1 d后經(jīng)60Co-γ射線輻照滅菌，一次性封口包裝收集。

2.2.2 兔脂肪干細胞-利福噴丁微球-骨支架的復合 經(jīng)前期實驗取得利福噴丁微球，精密稱取3 mg利福噴丁微球與400 μL的細胞懸液(細胞濃度為3×106/ mL)混勻后，緩慢均勻滴加至HA/β-TCP、同種異體骨支架空隙上，置于37℃培養(yǎng)箱中復合培養(yǎng)4 h后，待脂肪干細胞大部分貼壁后，緩慢沿皿壁加入DMEM完全生長液，計算細胞數(shù)貼壁率并定期培養(yǎng)行電鏡掃描觀察，了解三維復合后利福噴丁微球與兔脂肪干細胞在支架上的黏附、生長情況。

2.3 兔脊柱結核模型構建及治療

2.3.1 兔脊柱結核模型的構建 3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉，術區(qū)備皮，常規(guī)消毒。鋪雙層無菌洞巾，沿L3橫突向下至髂嵴做一長約3 cm縱行切口，逐層分開皮下、脂層，肌層，充分顯露L4～5椎體及左側椎旁，開路錐沿椎間盤邊緣鉆骨孔，深度約為0.6 cm，止血后，緩慢浸注結核菌懸液0.1 mL，表面用明膠海綿填塞，逐層關閉切口。術中嚴格遵守無菌操作及安全防護術后動物隔離分籠飼養(yǎng)。保持房間通氣良好，定時定點補食水，嚴格遵守動物倫理等原則，術后2個月通過影像學(DR、MRI)分析，可見椎體破壞、椎間隙變窄、椎旁膿腫者即為造模成功。

2.3.2 兔脊柱結核療效的研究 取36只造模成功、感染程度相似的家兔行病灶清除術，并將其隨機分為3組，A組于骨缺損處植入rADSCs/利福噴丁微球/HA/β-TCA抗結核骨組織工程復合體，B組于骨缺損處植入rADSCs/利福噴丁微球/同種異體骨抗結核骨組織工程復合體，C組清創(chuàng)后未做任何處理。逐層嚴密縫合脂層、皮下、表皮，術區(qū)切口涂抹紅霉素，預防感染，分籠常規(guī)條件飼養(yǎng)，定時通風換氣。

2.4 觀察指標

2.4.1 大體觀察 術后觀察兔飲食、活動及傷口愈合情況。處死的家兔將植骨處骨質連同周圍骨質一并取出，取材后觀察骨缺損修復、骨痂形成情況。

2.4.2 影像學檢查 造模2個月后行脊柱正側位DR照射及MRI檢查，了解造模情況；病灶刮除植入抗結核性骨組織工程復合體術后4、8、12周行脊柱正側位DR照射，參照Lane-sandhu X線評分法對骨缺損修復準進行評分。

2.4.3 組織病理學檢查 將取出的標本用4%甲醛固定，常規(guī)脫鈣，標本流水沖洗過夜，脫水，透明石蠟包埋，切片(厚度5 μm)，行HE染色，電子顯微鏡下觀察支架材料邊緣愈合情況，類骨質、骨質生成情況，有無炎性細胞浸潤以及利福噴丁微球降解情況。

3 結 果

3.1 兔脂肪干細胞的鏡下特點 鏡下可見原代rADSCs培養(yǎng)3～4 h貼壁，梭形，接種24 h后細胞基本完全貼壁，貼壁初期細胞形態(tài)不一，培養(yǎng)5～7 d后融合率高達80%～90%，傳代后rADSCs增殖速度明顯(見圖1)。

3.2 抗結核性骨組織工程復合體的鑒定 將利福噴丁微球與脂肪干細胞二維復合后與骨組織支架培養(yǎng)14 d后，期間定期更換培養(yǎng)液，電鏡掃描觀察到利福噴丁微球-rADSCs/HA/β-TCA及利福噴丁微球-rADSCs/同種異體骨兩種抗結核骨組織工程復合體表面呈不規(guī)則顆粒狀，微球緊緊黏附于細胞及支架上，微球保持圓形輪廓(見圖2～3)。

3.3 新西蘭大白兔脊柱結核模型的構建 兔脊柱結核模型術后2個月椎旁膿腫形成(見圖4)、L4～5椎間隙變窄(見圖5)，脊柱MRI提示椎旁膿腫形成(見圖6)。

圖1 第3代兔脂肪干細胞(×10)圖2 利福噴丁微球-rADSCs/同種異體骨復合體(SEM，×1 000)

圖3 利福噴丁微球-rADSCs/HA/β-TCA復合體(SEM，×400) 圖4 膿腫形成

圖5 術后2個月X線片示椎間隙變窄，椎體側彎 圖6 MRI提示椎旁膿腫

3.4 術后實驗動物基本情況及標本大體觀察 術后第1天A組1只兔子因術中牽拉傷及神經(jīng)，術后截癱；C組1只兔子因術中傷及神經(jīng)、血管，術后第2天出血過多死亡；術后第6天、7天空白組兔子因食欲不振、切口感染等原因死亡3只；術后4周實驗對照組1只兔子行DR檢查后第2天死亡，解剖未見明顯異常，考慮行DR檢查時，運輸途中過熱致死。其他動物均存活良好，及時補充各組實驗動物數(shù)量，術后12周取材時，所有實驗動物精神、飲食可，切口無感染、化膿，局部無明顯畸形。經(jīng)空氣栓塞處死后，取出L5及相鄰椎體骨標本，可見A組及B組骨缺損處基本修復，表面欠光滑，B組可見少量支架材料殘存，空白對照組缺損處可見有大量的纖維肉芽形成，骨缺損明顯，相鄰椎體畸形愈合(見圖7)。

a A組 b B組 c C組

3.5 影像學檢查 術后4周：A組骨缺損區(qū)少量骨痂形成，支架材料包埋于椎體缺損區(qū)，周邊可見散在高密度影(見圖8a)。B組缺損區(qū)材料填充明顯，材料與周圍骨組織界線尚清，周邊可見少許骨痂形成(見圖8b)，復合體材料與周圍組織界限模糊。C組椎體畸形，骨缺損區(qū)界線清晰，片狀低密度影，未見骨痂形成(見圖8c)。

a A組

b B組

c C組

術后8周：A組部分材料吸收，骨缺損區(qū)可見片狀密度增高影，邊界模糊(見圖9a)。B組骨缺損區(qū)可見絮狀高密度影，復合體與周圍骨組織界限模糊，可見較多骨痂形成(見圖9b)。C組脊柱側彎明顯，骨缺損未見明顯變化，缺損周邊可見點狀鈣化影(見圖9C)。

a A組

b B組

c C組

術后12周：A組骨缺損區(qū)復合體材料基本吸收，復合體與骨有骨性連接，兩椎體間基本融合(見圖10a)。B組骨缺損區(qū)大部分修復，部分骨痂形成，椎間隙融合，融合周邊可見高密度影，部分邊界模糊(見圖10b)。C組骨缺損區(qū)邊界尚清，缺損周邊可見片狀鈣化影，脊柱側彎明顯(見圖10c)。

a A組

b B組

c C組

根據(jù)X線片結果，按照Lane-SandhuX線評分標準進行骨缺損修復的放射學評分(見表2)。

表2 各組放射學評分

3.6 組織病理學檢查 術后12周：A組材料吸收明顯，可見成熟骨組織出現(xiàn)，結構不規(guī)則的骨小梁形成，少量成纖維細胞，新生骨組織排列規(guī)則(見圖11a)；B組部分材料殘留，可見新生骨細胞生成，纖維骨痂組織生成骨組織及少許類骨樣組織形成(見圖11b)；C組可見大量纖維結締組織，少許骨痂形成(見圖11c)。

a A組(×10) b B組(×10) c C組(×10)

4 討 論

脊柱結核是骨與關節(jié)結核中最常見的形式，在臨床上，因其具有較高的致殘率，而且面臨耐藥、復發(fā)、竇道形成等問題，給家庭及社會帶來了極大的負擔[8]。

全身聯(lián)合化療已經(jīng)是治療結核的首選方案，抗結核治療方案分為兩個階段：強化階段(初始階段)和持續(xù)階段，治療時間長達9個月[9]。而且在結核病治療過程中因患者抵抗力差，結核桿菌致病力強，骨結核口服藥很難保證局部血藥濃度。耐多藥結核病更是一種嚴峻的挑戰(zhàn)，在我國耐多藥結核病例和相關的耐多藥結核后遺癥的數(shù)量有所增加，其多見于應用異煙肼和利福平兩種抗結核藥物后。2016年，全球約有24萬人因耐多藥結核或耐藥結核病死亡。耐多藥結核病的治療成本更高，毒性更大，并且比治療藥物易感性結核的時間更長，為我們行結核病防治帶來更大的挑戰(zhàn)[10-11]。

雖然化療是抗結核治療的基本方法，有數(shù)據(jù)顯示單純保守治療的平均脊柱塌陷為15%～20%，而及時的外科干預可以有效地降低椎體塌陷致截癱等并發(fā)癥。目前脊柱結核的外科治療多采用病灶清除術，必要時行植骨融合內固定術，由病灶清除術后骨缺損所造成的脊柱穩(wěn)定性下降一直是外科治療所面臨的難題[12-13]。自體骨移植是骨缺損修復的“金標準”[14]，但由于自體骨來源有限，易出現(xiàn)取骨區(qū)感染、疼痛等癥狀，內固定技術在解決因骨缺損導致的脊柱穩(wěn)定性下降方面具有一定的優(yōu)勢，但因術中病灶清除不徹底、術后因患者營養(yǎng)差、未進一步正規(guī)化療等因素導致局部復發(fā)，給患者帶來嚴重的負擔。

在骨結核治療中，局部植入能夠有效保持抗結核藥物濃度并促進骨缺損修復的生物工程復合體成為近來研究的熱點。結核性骨缺損的修復不僅需要促進缺損愈合，更重要的是徹底的清除、消滅結核桿菌，降低復發(fā)率，減少耐藥菌的發(fā)生。自體移植技術中提供最佳的骨誘導性、骨傳導性和成骨特性。由于自體移植增加額外傷口，供區(qū)疼痛和骨供應不足等缺點[15-17]，因此研發(fā)新型骨缺塤修復材料迫在眉睫。

天然高分子復合材料利用組織工程學的原理和方法，通過對缺損骨組織修復并重建，它不僅滿足自體骨的優(yōu)點，同時避免二次創(chuàng)傷等缺點[18-19]。理想的骨組織工程支架材料不僅需要具備適合細胞生長的環(huán)境及細胞親和性，而且需要維持較好的生物相容性、骨傳導性、高孔隙率和生物力學相容性等優(yōu)勢。種子細胞、支架材料、細胞生長和分化因子作為骨組織工程的三個基本要素[20]。理想的種子細胞應取材方便，來源豐富，對機體損傷小，具備定向分化為成骨的能力。rADSCs是多能干細胞，具有分化成不同譜系的能力并分泌啟動組織再生過程的旁分泌因子，且脂肪組織的供應充足，易于分離，體外廣泛的增殖能力以及分泌促血管生成生長因子的能力使其成為治療非愈合性傷口的理想細胞類型[21-22]。HA/β-TCA構成的復合材料是目前廣泛應用于臨床的人工復合材料。Tang等[23]將兔自體脂肪干細胞接種于納米羥基磷灰石復合支架上，研究脊柱融合，發(fā)現(xiàn)復合體的融合率及新骨生成量明顯高于單純支架組，李海建等[24]將分化誘導后的rADSCs與HA/β-TCA復合材料體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)rADSCs較均勻的黏附在復合體上，并填充于支架材料微孔中，細胞在復合體上生長良好，增殖明顯。龍志成等[25]在脊柱骨缺損修復的體內實驗發(fā)現(xiàn)，將rADSCs/HA/β-TCA復合材料與rADSCs/同種異體骨進行對比，rADSCs/HA/β-TCA具有較好的生物黏附性及促進新骨形成的能力。

脊柱結核治療過程中，如何提高局部結核藥物的血藥濃度，降低耐藥的發(fā)生風險，減少化療副反應是研究的重點，微球靶向等技術的發(fā)展為脊柱結核局部給藥提供了新的思路。因抗結核藥物的時間長、副作用大等缺點，如能通過改變現(xiàn)有抗結核藥物劑型，達到局部控制藥物濃度，有效降低藥物毒副作用具有重要意義，利福噴丁具有很好的脂溶性，且有效抗結核桿菌作用強，本課題組制備的利福噴丁微球具有較好的載藥率及包封率。吳林波等[26]將利福噴丁微球與脂肪干細胞二維復合，發(fā)現(xiàn)其利福噴丁微球對兔脂肪干細胞生長、增殖的影響較小。梁求真等[27-28]在體外以同種異體骨為支架材料構建的抗結核性骨組織工程復合體的實驗研究，發(fā)現(xiàn)該復合體具有持續(xù)緩慢釋放藥物的性質，且該釋藥濃度不影響rADSCs的成骨活性。本實驗將分化誘導后的rADSCs與利福噴丁微球二維復合后構建的HA/β-TCA復合材料、同種異體骨構建的兩種抗結核性骨組織工程復合體，在脊柱結核造成的骨缺損的對比研究中發(fā)現(xiàn)以HA/β-TCA為支架構建的抗結核性骨組織工程復合體，利于骨缺損的修復，而且具有較好的生物相容性。該方案為結核性骨缺損修復材料進行初步研究和探索，為構建抗結核性骨組織工程復合體的局部治療提供一種新的思路，為臨床治療提供一種方法。但因脂肪干細胞與利福噴丁微球相關方面研究較少，且構建的抗結核骨組織工程復合體在實驗動物脊柱結核模型中的動物數(shù)量較少，且觀察時間短，對該復合材料體內藥物特征及成骨修復方面需進一步研究。

綜上所述，以HA/β-TCA為支架材料構建的利福噴丁微球抗結核性骨組織工程復合體具有良好的生物相容性及成骨性，可以通過增加局部藥物濃度抑制結核桿菌生長，減少椎體骨質破壞，在動物實驗基礎研究中，對脊柱結核具有一定的治療作用。