Th17及Treg在卵巢癌中的表達及其臨床意義研究

孫孟雄 楊 麗 王娟娟 胡亞麗 李芙琴

輔助性T細胞17(T help cell 17，Th17)屬于T淋巴細胞及亞群CD4+T。作為CD4+T細胞亞群，高水平地分泌白細胞介素17(interleukin-17，IL-17)，被命名為Th17細胞[1]。調節性T細胞(Treg)是一組具有維持自身免疫耐受功能的CD4+T細胞亞群，該類細胞的數量和功能障礙可使其對效應T細胞的抑制功能減弱，從而導致機體外周免疫的失衡[2]。Th17細胞被普遍認為是一群介導炎性反應的重要細胞[3-5]。而國內外學者研究證實Treg細胞在卵巢癌患者體內數量、功能異常，可能與卵巢癌的發生發展有關[6-8]。Th17與Treg均屬于CD4+T細胞亞群，具有一定的可塑性，通過細胞因子相互影響、制約維持動態平衡。在分化及功能上Th17/Treg是一對相互制約的平衡體系，維持著機體的免疫穩定，一旦平衡打破，機體會發生免疫功能失常，導致疾病的發生，如炎癥、腫瘤及免疫性疾病等[9-10]。

卵巢癌是一種常見的易發于女性生殖系統的惡性腫瘤，其發病率低于宮頸癌和宮體癌，但因為卵巢癌發病隱匿，絕大多數患者無明顯臨床癥狀，導致其普查和早期診斷缺乏，所以70%以上患者就診時已至晚期，治療和預后效果很差，致死率占各類婦科腫瘤的首位[11]。目前卵巢癌的發病機制依然未研究透徹，可能與女性外源性激素、月經、妊娠及哺乳、病毒感染、飲食、遺傳因素、癌基因與抑癌基因、精神因素等多方面因素有關[12]。截止目前，歐美公認的卵巢癌的腫瘤標志物只有糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)[13]。因此，亟需找到一種與CA125同樣符合卵巢癌腫瘤標志性的指標，本研究通過流式細胞儀檢測各期卵巢癌患者外周血中的Th17細胞與Treg細胞，并結合患者CA125結果進行相關性分析，期望得到在卵巢癌發病過程中Th17/Treg平衡狀態改變對卵巢癌發病可能發揮的作用，并研究Th17/Treg與CA125的相關性，以期能找到另一個卵巢癌腫瘤標志性指標。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2017年6月在張家口市第一醫院婦科住院醫治的45例卵巢癌患者，將其納入卵巢癌組，年齡31～75歲，平均年齡(45.14±17.29)歲，所有病例均經病理證實為上皮性卵巢癌。按照國際婦產科聯合會(Federation International of Gynecology and Obstetrics，FIGO)2000年手術-病理分期標準，Ⅰ期5例，Ⅱ期9例，Ⅲ期18例，Ⅳ期13例。所有病例排除自身免疫性疾病、感染及嚴重的心肝腎疾病，采集樣本前未進行免疫治療、手術及化療。同期選取45名女性健康體檢者為正常對照，并將其納入健康對照組。該研究取得醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

(1)儀器。采用FASCCanto型流式細胞儀(美國BD公司)；Advia Centaur型全自動化學發光儀(美國Bayer公司)。

(2)試劑。鞘液ISOTON Ⅲ血細胞稀釋液(美國Backman Coulter公司)；改良型RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute1640 洛斯維1604培養基)(北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司)；氟波酯(phorbol ester，PMA)、離子霉素(Ionomycin)及布雷桿氏菌素A(brefeldinA，BFA)(美國Sigma公司)；破膜劑(美國Invitrogen公司)；IL-17A-FITC(美國eBioscience公司)；CD25-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC單克隆抗體(美國Beckman coulter immunotech)；CAl25檢測使用Advia Centaur全自動化學發光儀。

1.3 標本收集與細胞刺激和培養

(1)卵巢癌組患者均自入院第2 d清晨，空腹平臥位采集肘靜脈血5 ml兩管；健康對照組為體檢女性，亦空腹采集肘靜脈血5 ml兩管，1管肝素鈉采集，1管普通管采集。

(2)取采集到的血液樣本100 μL，加入100 μL RPMI1640培養液混勻，再加入5 μL PMA工作液，5 μL Ionomycin工作液，40 μL BFA工作液，體系中PMA、Ionomycin、BFA終濃度分別為25 μg/L、1.0 g/L和1.7 g/L。在37 ℃，5%CO2培養箱中刺激培養5 h，取出細胞進行標記。

1.4 檢測方法

(1)Th17、Treg細胞標記及頻數檢測。取100 μl經刺激培養的全血細胞，加入10 μl CD4-FITC單克隆抗體，室溫避光孵育15 min。100 μl固定液(A液)室溫避光固定反應15 min，加入3 ml PBS，混勻離心棄上清。加入100 μl破膜劑(B液)進行細胞打孔利于細胞因子染色，加入IL-17A-FITC 20 μl，室溫避光孵育20 min后，加入3 ml磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)，靜置10 min，離心棄上清，再加入0.5 ml PBS懸浮細胞，流式細胞儀檢測。根據CD4設門圈定T淋巴細胞群，分析CD4+-17A+T細胞。

(2)CD4+CD25+T細胞檢測。取100 μL經刺激培養的全血細胞，加入CD25-PerCP-Cy5.5抗體、CD4-FITC抗體各5 μl，設同型對照管，室溫暗室孵育20 min后，加入紅細胞破膜劑100 μl進行細胞打孔利于細胞因子染色，室溫暗室孵育10 min。洗滌后，用磷酸鹽緩沖液500 μl重懸細胞，于24 h內流式細胞儀檢測，根據CD4設門圈定T淋巴細胞群，結果即為CD4+CD25+T細胞。

(3)CA125檢測。經由同位素科進行檢測，在美國Bayer公司Advia Centaur全自動化學發光儀上測定。

1.5 觀察與評價指標

比較兩組外周血中Th17、Treg與Th17/Treg細胞頻數；比較卵巢癌組患者分期外周血中Th17、Treg與Th17/Treg細胞頻數；同時比較卵巢癌患者分期外周血中CA125、Th17與Treg細胞頻數。

1.6 統計學方法

對兩組數據資料使用SPSS 19.0統計學軟件分析、處理，所得數值均采用均數±標準差(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，方差不齊時采用Wilcoxon秩和檢驗，相關性分析采用Pearson分析，相關系數用r表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組外周血中Th17、Treg與Th17/Treg細胞頻數比較

(1)檢測結果顯示，卵巢癌組外周血中Th17細胞表達頻率為(2.98±0.67)%，健康對照組外周血表達頻率為(1.57±0.50)%，卵巢癌組Th17細胞表達頻率顯著高于健康對照組，差異有統計學意義(t=11.16，P＜0.01)，如圖1所示。

圖1 流式細胞儀檢測Th17細胞表達頻率示圖

(2)卵巢癌組外周血T r e g細胞表達頻率為(15.37±2.34)%，健康對照組外周血表達頻率為(5.49±1.26)%，卵巢癌組Treg細胞表達頻率顯著高于健康對照組，差異有統計學意義(t=24.95，P＜0.01)，如圖2所示。

圖2 流式細胞儀檢測Treg細胞表達頻率示圖

(3)在Th17/Treg中卵巢癌組與健康對照組比較差異亦有統計學意義(t=17.14，P＜0.01)，見表1。

表1兩組外周血Th17、Treg 和 Th17/Treg細胞表達率(%，±s)

表1兩組外周血Th17、Treg 和 Th17/Treg細胞表達率(%，±s)

組別 例數 Th17細胞 Treg細胞 Th17/Treg卵巢癌組 45 2.98±0.67 15.37±2.34 19.10±1.50健康對照組 45 1.57±0.50 5.49±1.26 27.97±3.13 t值 11.16 24.95 17.14 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.2 卵巢癌組患者分期外周血中Th17、Treg與Th17/Treg細胞頻數比較

在卵巢癌分期中可見Th17與Treg細胞在Ⅰ～Ⅱ與Ⅲ～IV期間差異均有統計學意義(t=4.62，t=7.811；P＜0.01)，但Th17/Treg在分期中無顯著差異(t=0.654，P＞0.05)，見表2。

表2 卵巢癌患者外周血Th17、Treg與Th17/Treg細胞與卵巢癌TNM分期特征關系(±s)

表2 卵巢癌患者外周血Th17、Treg與Th17/Treg細胞與卵巢癌TNM分期特征關系(±s)

細胞(%) 例數 TNM分期 t值 P值Ⅰ～Ⅱ(14例) Ⅲ～Ⅳ(31例)Th17 2.40±0.59 3.23±0.54 4.62 ＜0.01 Treg 12.73±1.06 16.56±1.68 7.811 ＜0.01 Th17/Treg 18.78±3.81 19.75±4.23 0.654 0.53

2.3 卵巢癌患者分期外周血中CA125、Th17與Treg細胞頻數比較

在45例卵巢癌患者中有6例檢測CA125結果未收集到，因此分析39例卵巢癌患者的CA125檢測數據，此間CA125、Th17與Treg細胞在卵巢癌分期中比較差異均有統計學意義(t=4.873，t=7.947，t=9.114；P＜0.01)，見表3。

表3卵巢癌患者外周血CA125、Th17與Treg細胞與卵巢癌分期特征關系(±s)

表3卵巢癌患者外周血CA125、Th17與Treg細胞與卵巢癌分期特征關系(±s)

細胞(%) TNM分期 t值 P值Ⅰ～Ⅱ(13例) Ⅲ～Ⅳ(26例)Th17 2.43±0.60 3.28±0.55 4.873 ＜0.01 Treg 12.86±0.99 16.88±1.65 7.947 ＜0.01 CA125 74.76±30.15 380±170.38 9.114 ＜0.01

2.4 卵巢癌組患者外周血中CA125與Th17、Treg、Th17/Treg細胞相關性

卵巢癌組患者外周血中CA125與Th17、Treg、Th17/Treg細胞相關性分析。在卵巢癌患者外周血檢測中，CA125與Th17、Treg及Th17/Treg細胞呈正相關(r=0.656，r=0.749，r=0.358；P＜0.05)，見表4。

表4卵巢癌患者外周血CA125與Th17、Treg及Th17/Treg細胞相關性分析

3 討論

Th17細胞屬于CD4+T細胞群的一組細胞亞群，會在多種免疫性疾病中呈現多克隆和過度激活狀態，其主要分泌IL-17A、IL-17F和腫瘤壞死因子(TNF-α)等細胞因子，正是這些炎癥介質參與介導免疫細胞在局部組織中的浸潤。多項研究論證了Th17細胞及其分泌的主要細胞因子IL-17A參與了多種自身免疫性疾病的病理生理過程[14-18]。有國外研究者發現，卵巢癌患者的腫瘤組織中Th17細胞的數量與卵巢癌疾病分級有關[19]。王麗華等[20]在卵巢癌外周血液Th17細胞頻數研究中發現，CD3+CD4+-17A+細胞頻數百分率增多，與臨床分期相關，與細胞分化與組織類型無關。Treg細胞主要發揮免疫抑制作用，與許多腫瘤的發生呈正相關，包括乳腺癌、宮頸癌等，外周血中Treg細胞的百分率升高與腫瘤的分期、大小及淋巴轉移呈正相關[21-22]。在本研究中發現Th17細胞與Treg細胞頻數的增加均與卵巢癌的發生有關，且Th17/Treg在病例組中明顯低于對照組，可從側面顯示在卵巢癌發生發展過程中Treg的增長要多于Th17的增長，但這個比值在卵巢癌分期中并無明顯的差異。

在卵巢癌患者外周血CA125與Th17、Treg、Th17/Treg細胞的分析中可以發現，CA125在卵巢癌分期中有顯著差異，而且在對這幾個指標進行相關性分析時發現，CA125與其他指標都存在著正相關性。截止目前，歐美公認的卵巢癌的腫瘤標志物只有CA125，在國內一般也是最多使用CA125或CA125與其他腫瘤標志物共同評估與先期診斷[23-25]。本研究的相關性結果可以從一方面顯示Th17、Treg、Th17/Treg指標與CA125有較強的相關性，有可能成為與CA125聯合診斷卵巢癌的一種指標。

卵巢癌患者外周血中Th17與Treg細胞數量比正常人體內顯著增多，其參與了卵巢癌的發生及發展過程。進一步研究其在卵巢癌發病的不同時期的變化，將有助于全面了解卵巢癌患者機體的免疫狀態，為卵巢癌的免疫治療提供理論支持。本研究發現，CA125與Th17、Treg、Th17/Treg呈正相關，可以從一方面顯示Th17、Treg及Th17/Treg的增高與CA125的增高速度類似，有可能與其他指標結合，評估或診斷卵巢癌，但因本研究案例較少，所以要得出準確的結果還需待以后研究。