流式細胞術與免疫組織化學技術在淋巴結增生性疾病中的比較研究

薛曉偉 李星奇 王德田*

流式細胞術(flow cytometry，FCM)是對快速直線流動狀態中的單個細胞進行分析的技術，其可快速、準確和客觀地檢測細胞的多項物理及生物學特性，并可進行定量分析，同時還可對特定細胞群體加以分選[1]。FCM雖然在我國起步較晚，但近年來發展迅速，已成為研究細胞生物學的重要工具[2-4]。FCM在血液病學診斷方面具有重要的作用，尤其是流式免疫分型的應用使白血病和淋巴瘤的診斷變得快捷和容易。對于病理科而言，在淋巴瘤的診斷中免疫組織化學技術起著舉足輕重的作用，而引入FCM是對形態診斷的提示和補充。本研究旨在對FCM與免疫組織化學技術在淋巴結增生性疾病中的作用進行探討。

1 材料與方法

1.1 標本采集

收集2016年12月至2017年5月北京協和醫院46例患者，其中40例為門診淋巴結腫大患者，6例為住院發熱待查患者；男性24例，女性22例；年齡14～81歲，平均年齡(37.6±3.4)歲。共采集標本46例，分別是鎖骨上淋巴結20例，腹股溝淋巴結16例，腋窩淋巴結10例，所有經手術切除淋巴結均為進行固定，經多點取材進行流式檢測，剩余組織固定脫水，進行形態學檢測。所有患者均參照2008年世界衛生組織(WHO)造血與淋巴組織腫瘤分類標準診斷[5]。

1.2 儀器與試劑

(1)儀器。VIP6型全自動組織脫水機(日本櫻花公司)；RM2235型輪轉式石蠟切片機(德國徠卡公司)；CV5030型全自動HE染色封片機(德國徠卡公司)；FACSAria型流式細胞儀(美國BD公司)，流式分析采用FACSDiva軟件；BOND型全自動免疫組織化學儀(德國徠卡公司)。

(2)試劑。流式細胞法用單克隆抗體和配套試劑(美國BD公司)；免疫組織化學法用單克隆抗體和配套試劑(德國徠卡公司)。

1.3 流式細胞標本制備及檢測

(1)標本的保存。淋巴結標本置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，4 ℃，保存48 h內處理；或者置于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)，即刻上機使用。

(2)單細胞懸液制備。眼科剪或手術刀柄分離組織，18 G的細針頭反復吸取，濾網過濾，PBS洗滌3次，懸浮于0.5～1 ml洗液備用。

(3)細胞計數。調整標記105細胞即可，細胞濃度=細胞計數4個大格細胞數÷4×稀釋倍數×104/ml。

(4)標記。在制備好的單細胞懸液中分別加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、(peridininchlorophyll-protein complex，PerCP)和(allophycocyanin，APC)的4種熒光素標記的單抗[6]避光孵育20 min。

(5)洗滌。加入1 ml的PBS，以300 g離心洗滌5 min。

(6)上機檢測。棄去上清，加入PBS 200～500 μl，上機檢測。如不能及時上機，則加入同體積的1%多聚甲醛，混勻后置于4 ℃冰箱內保存，一般≤24 h。在標記Kappa和lambda抗體時，為避免Fc受體的非特異性結合，要先用PBS洗滌待測標本3次，離心后再標記。

(7)參數分析。采用雙變量散點圖的方式對結果進行輸出。雙變量散點圖包括散射光和熒光染色，即在每個雙變量散點圖中，設定4個區域：細胞未結合任何抗體(雙陰性)、僅結合一種抗體或結合另一種抗體(單陽性)和結合兩種抗體(雙陽性)的區域。

1.4 組織學檢測方法

淋巴結組織經10%甲醛固定后，全自動組織脫水機進行脫水處理，包埋、制片及HE染后，鏡下診斷，對于懷疑淋巴瘤的切片進行免疫組組化學染色分析。其中，T淋巴細胞及亞群的表面標記物CD5、CD10和CD23均為細胞膜陽性表達。

1.5 淋巴細胞系別和分化階段的判定

CD3、CD5主要表達T細胞，CD4主要表達于輔助和(或)誘導T細胞，CD7表達于大部分T細胞和部分NK細胞，CD8表達于抑制和(或)細胞毒性T細胞，B細胞表達CD10、CD19、CD20、cCD22及CD79α，CD56在NK細胞淋巴瘤中均高表達，CD5、CD3、CD19及CD20規則地在非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)各亞型淋巴瘤細胞中表達。

1.6 統計學方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件對數據結果進行統計，兩組之間的差異進行卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞檢測結果

FCM技術共檢測標本46例，其中篩選出B系淋巴瘤25例，基本正常標本21例。

2.2 組織學檢測結果

經形態學分析，46例標本中有15例為淋巴結反應增生性疾病，1例為淋巴結結核，5例為轉移癌，25例為B系淋巴瘤。B系淋巴瘤中有14例彌漫大B淋巴瘤，6例濾泡性淋巴瘤，5例套細胞淋巴瘤。

表1 兩種技術檢測CD5、CD10和CD23抗體表達的關系(例)

2.3 FCM與免疫組織化學技術一致性對比

(1)在46例標本中，進行免疫組織化學技術檢測并與FCM檢測有重合的標本有40例，其中，兩種技術檢測重合的抗體主要涉及CD5、CD10和CD23，兩組間無統計學差異(x2=0.05，x2=0.05，x2=0.00；P＞0.05)，見表1。

(2)兩種技術檢測重合的抗體陽性一致性比對抗體的表達如圖1、圖2所示。

圖1 免疫組化法檢測CD5示圖

圖2 流式細胞術檢測CD5示圖

3 討論

FCM技術和免疫組織化學技術的基本原理都是抗原—抗體反應，但是檢測的對象不同。免疫組織化學檢測對象往往是組織切片，而流式的檢測對象是活體的細胞。免疫組織化學技術需要在抗原—抗體結合后，經過顯色反應，病理醫師結合鏡下結構對顯色的結果進行判讀。而流式細胞儀利用鞘液和氣體壓力將樣本細胞依次輸送到測量區，并在細胞受激光激發后，收集光信號，并將光信號轉換為電子信號，量化后傳遞給計算機。由于流式細胞儀的對象無需固定、切片等步驟，因此較傳統的免疫組織化學的方法更加快捷。但是流式檢測往往在HE染色之前，存在一定的盲目性，因此初篩方案中抗體的確定就顯得尤為重要。

在本研究中采用的流式抗體初篩方案中，確定B細胞克隆性通常是診斷B細胞淋巴瘤的關鍵，因為區分腫瘤性過程和反應性過程最重要的特征就是前者的克隆性，幾乎所有的腫瘤性疾病均為單克隆，而大多數良性反應性疾病則是多克隆性[7]。確定克隆性的標準是直接或間接，對于B細胞淋巴瘤而言，其免疫球蛋白輕鏈限制性是其克隆性的最直接和可靠的證據。而FCM通過檢測B細胞Kappa和lambda輕鏈比率進而判斷是否呈輕鏈限制性是確定B細胞克隆性最方便和有效的方法。對非腫瘤性樣本的研究發現，B細胞Kappa和lambda輕鏈比率通常在1∶1～2∶1范圍內[8-11]。B細胞淋巴瘤表達單克隆輕鏈，這一比率通常增大(Kappa陽性淋巴瘤)或減小(lambda陽性淋巴瘤)。一旦確定為B系淋巴瘤，可根據CD5、CD23、FMC-7和CD10的表達將淋巴瘤進行分類[12-13]。在此類初篩方案中，雖然單克隆性是診斷B細胞淋巴瘤的必要條件，但應注意的是，單克隆不一定是B細胞淋巴瘤，如生發中心B細胞增生、炎癥及病毒感染等導致Kappa/lambda比值異常的病變；與此相反，在同一標本中如果良性反應性B細胞較多，則實際檢測得出的Kappa和lambda比率在上述正常范圍內，可能會掩蓋腫瘤細胞而出現假陰性。然而，對于上述兩種情況，可以從其他診斷線索中加以明確，如利用前向散射(forward scatter，FSC)及側向散射(side scatter，SSC)提供的關于細胞大小和胞漿、胞核的復雜性信息，或其他免疫標志表達水平的改變所提供的信息，以將腫瘤細胞群與良性細胞群區分開來，盡可能的避免正常細胞對克隆性分析結果若存在Kappa和lambda雙陰性的情況，還可能是部分腫瘤如B-淋母，本身表面免疫球蛋白輕鏈表達缺乏或減弱；或者輕鏈確實存在而流式測陰性的淋巴瘤，如彌漫大B等[14-15]。

但是，FCM缺乏形態學的相關證據，如經典型霍奇金淋巴瘤特征性RS細胞等無法獲得鏡下資料。此外，由于取材受限，FCM有可能忽略病變部位造成假陰性的情況出現，在本次實驗中就出現了兩次假陰性的結果，雖然對診斷未造成影響，但這種情況還需要以后的流式操作中加以重視。本研究由于事先尚無相關的病理診斷信息，因此入組的標本量少，缺乏T細胞、NK細胞及漿細胞淋巴瘤的相關數據分析，需要在日后的工作中增大樣本量進行分析。

對于病理活檢標本，在標本量足、具有代表性及細胞活力好的情況下，FCM能夠快捷地提供淋巴瘤診斷、分型及質量相關的所有信息，為形態學診斷提供可能的方向。鑒于目前淋巴結增生性疾病還是以形態學為金標準的條件下，FCM對于淋巴結增生性疾病的診斷更為快速，是形態學有力的補充。