市售農(nóng)殘速測(cè)儀對(duì)青菜中毒死蜱和三唑磷的檢測(cè)評(píng)價(jià)

汪志威，沈玉姣,2，徐浩，周思齊，徐霞紅，齊沛沛，王祥云，狄珊珊，王新全*

(1.省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地“浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)藥殘留檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江師范大學(xué) 行知學(xué)院，浙江 金華 321004)

果蔬中的農(nóng)藥殘留問(wèn)題一直受到群眾的普遍關(guān)注，目前浙江省主要的生產(chǎn)基地、批發(fā)市場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市等基層食品安全質(zhì)監(jiān)部門均已配備了農(nóng)殘速測(cè)儀，主要用于對(duì)蔬菜中有機(jī)磷與氨基甲酸酯農(nóng)藥的快速檢測(cè)。它基于酶抑制率法的原理，具有前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、不需昂貴的儀器、易于掌握等優(yōu)點(diǎn)[1-3]。在上世紀(jì)80年農(nóng)殘速測(cè)儀得到了快速的發(fā)展，是目前研究最多，相對(duì)成熟，且在全省范圍內(nèi)使用最廣泛的一種農(nóng)藥快速檢測(cè)技術(shù)[4]。

毒死蜱和三唑磷是典型的有機(jī)磷農(nóng)藥，屬于農(nóng)殘速測(cè)儀篩查范圍[5]。過(guò)去在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上也曾被推薦和廣泛使用，但隨著新型高效低毒農(nóng)藥的開發(fā)和農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)要求的不斷提高，自2016年12月31日起，依據(jù)農(nóng)業(yè)部2 032號(hào)公告毒死蜱和三唑磷被禁止在蔬菜上使用。

目前針對(duì)農(nóng)殘速測(cè)儀的方法標(biāo)準(zhǔn)主要有GB/T 5009.199—2003 蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)，NY/T 448—2001蔬菜上有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)方法，以及國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局公布的食品快速檢測(cè)方法《蔬菜中敵百蟲、丙溴磷、滅多威、克百威、敵敵畏殘留的快速檢測(cè)》(KJ201710)等，然而上述標(biāo)準(zhǔn)和方法均未規(guī)定對(duì)新禁用農(nóng)藥毒死蜱和三唑磷的檢測(cè)靈敏度范圍。目前市場(chǎng)上使用的農(nóng)殘速測(cè)儀產(chǎn)品眾多，涉及品牌包括博納，復(fù)訊，瑞鑫，托普，天邁，藤蔓等13余個(gè)品牌，配套的酶試劑來(lái)源不同且具有明顯的性能差異，因而評(píng)價(jià)市售速測(cè)儀產(chǎn)品對(duì)毒死蜱和三唑磷靈敏度，可以為更新和制定相關(guān)速測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供重要數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和設(shè)備

毒死蜱和三唑磷標(biāo)準(zhǔn)品為購(gòu)自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所(天津)的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為1 000 mg·L-1。青菜購(gòu)自杭州東新農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，經(jīng)試劑盒檢測(cè)結(jié)果為陰性，且抑制率均≤10%。市售的9種農(nóng)殘速測(cè)儀按照調(diào)研順序排列，分別編為A、B、C、D、E、F、G、H、I，相應(yīng)的酶試劑生產(chǎn)批次在2017年1—7月。青菜樣品前處理QuEChERS方法凈化材料包括乙酸鈉，無(wú)水硫酸鎂，石墨化炭黑，PSA和C18購(gòu)自天津艾杰爾公司。氣相色譜-火焰光度檢測(cè)器(GC-FPD)，型號(hào)為TRACE GC Ultra，由美國(guó)Thermo Electron Corpration公司生產(chǎn)。

1.2 方法

樣品前處理。市售青菜樣品剪成1 cm× 1 cm，稱取2 g菜樣于50 mL離心管中若干份，按需要添加不同濃度梯度的毒死蜱或三唑磷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，靜置30 min。加入10 mL緩沖液后，振蕩提取5 min。

1.2.1 農(nóng)殘快速檢測(cè)

緩沖溶液、顯色劑、酶試劑和底物的配置。試劑的配置嚴(yán)格按照各廠家說(shuō)明書執(zhí)行，緩沖鹽溶液的配置分為單包裝直接溶解和2個(gè)包裝混合溶解，酶試劑的配置分為5 mL和3.1 mL緩沖鹽溶液2種類型。

樣品(對(duì)照)制備。取上清液(對(duì)照為2.5 mL緩沖鹽空白溶液)2.5 mL于10 mL離心管中，加入100 μL酶試劑，100 μL顯色劑，混勻后在37 ℃水浴中靜置10 min，然后加入100 μL底物后，轉(zhuǎn)入比色皿上農(nóng)殘速測(cè)儀分析[6]。

1.2.2 色譜檢測(cè)

分別將青菜和對(duì)應(yīng)緩沖提取液分成2份樣品，分別按照下述步驟前處理。

將青菜樣品適當(dāng)瀝干后轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，加入10 mL乙腈溶液，勻漿1 min，加入4 g 無(wú)水硫酸鈉和1 g氯化鈉，渦旋1 min，7 000 r·min-1離心后取上清液5 mL，氮吹至少于1 mL，用乙腈定容至1 mL，加入40 mg PSA和40 mg C18，充分混勻后7 000 r·min-1離心3 min，取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)膜后上機(jī)GC-FPD檢測(cè)。

從提取液中取5 mL置入50 mL離心管，加入10 mL乙腈溶液，振蕩1 min，加入4 g無(wú)水硫酸鎂和1 g氯化鈉充分混合。離心3 min后取上清液2 mL，加入40 mg PSA和40 mg C18，充分混勻后7 000 r·min-1離心3 min，取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)膜后上機(jī)GC-FPD檢測(cè)。

1.3 處理設(shè)計(jì)

1.3.1 青菜樣品中靈敏度試驗(yàn)

按照速測(cè)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.199—2003制備72份2 g空白青菜，分別添加6組標(biāo)樣，添加水平分別為0.1、0.5和5 mg·kg-1毒死蜱，0.1、0.5和5 mg·kg-1三唑磷，重復(fù)12組，其中3組平行樣通過(guò)色譜檢測(cè)，另外9組平行樣品分別通過(guò)農(nóng)殘速測(cè)儀A、B、C、D、E、F、G、H、I及配套試劑盒上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 緩沖鹽提取液靈敏度試驗(yàn)

在靈敏度測(cè)試時(shí)使用各個(gè)品牌的農(nóng)殘速測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)試，同時(shí)為減少因檢測(cè)儀器帶來(lái)的系統(tǒng)誤差，本試驗(yàn)使用農(nóng)殘速測(cè)儀A對(duì)各品牌試劑盒靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

首先，配置緩沖鹽溶液2 L作為提取液，其次，使用提取液分別配置濃度梯度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、1、2、3、4和5 mg·L-1毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4和5 mg·L-1三唑磷標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 mL。在提取液靈敏度測(cè)試時(shí)根據(jù)抑制率結(jié)果適當(dāng)調(diào)整測(cè)試濃度，通常以2倍濃度調(diào)增或調(diào)減。

1.4 靈敏度

采用毒死蜱或三唑磷標(biāo)準(zhǔn)品，加入蔬菜樣品中靜置30 min，因抑制率與農(nóng)藥殘留含量成正相關(guān)，且抑制率≥50%為陽(yáng)性。測(cè)定某種農(nóng)藥?kù)`敏度即檢出限，用此農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品添加，使得抑制率為50%，即為此種農(nóng)藥檢出限，在試驗(yàn)時(shí)添加后剛好測(cè)定抑制率為50%難以操作，因此添加使得抑制率接近且大于50%所對(duì)應(yīng)的添加濃度即為靈敏度[7-8]。

2 結(jié)果與分析

基于酶抑制率法的農(nóng)殘速測(cè)儀，其原理是利用有機(jī)磷與氨基甲酸酯類農(nóng)藥可特異性地抑制昆蟲中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)的活性，破壞神經(jīng)的正常傳導(dǎo)，是昆蟲中毒致死這一毒理學(xué)原理[9-10]。將AChE與樣品反應(yīng)，如果試樣中沒(méi)有農(nóng)藥殘留或者殘留量極少，AChE的活性就不被抑制；反之，如果農(nóng)藥殘留量比較高，AChE的活性就會(huì)被農(nóng)藥所抑制[11-12]，而抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)。

2.1 毒死蜱和三唑磷基于色譜分析的添加回收率

為驗(yàn)證色譜檢測(cè)方法能有效應(yīng)用于緩沖鹽溶液和青菜中毒死蜱和三唑磷的殘留檢測(cè)，本試驗(yàn)分別往2 g空白青菜和5 mL緩沖鹽溶液A中添加毒死蜱和三唑磷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，農(nóng)藥添加水平分別為青菜0.05和0.25 mg·kg-1，緩沖鹽溶液0.1和0.5 mg·L-1。結(jié)果如表1所示，青菜的添加回收率86.1%～108.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.1%～0.6%，緩沖鹽溶液中農(nóng)藥的回收率80.1%～84.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.2%～0.9%。

表1 色譜分析方法對(duì)青菜和緩沖鹽溶液中的 添加回收率

2.2 農(nóng)殘速測(cè)儀在添加毒死蜱和三唑磷青菜樣品中的篩查結(jié)果

本試驗(yàn)在青菜樣品中分別添加毒死蜱和三唑磷，共添加3個(gè)濃度水平0.1、0.5和5 mg·kg-1的毒死蜱。速測(cè)結(jié)果顯示(表2)，在0.1和0.5 mg·kg-1添加水平時(shí)，9種速測(cè)儀對(duì)青菜樣品中的毒死蜱和三唑磷均為陰性；在5 mg·kg-1毒死蜱添加水平下的青菜，A和B兩種速測(cè)儀檢出陽(yáng)性，其余均為陰性；在5 mg·kg-1三唑磷的添加水平下，僅B、C和E篩查結(jié)果為陽(yáng)性，且為弱陽(yáng)性，其余均為陰性。

為驗(yàn)證青菜樣品添加毒死蜱和三唑磷后的真實(shí)濃度，防止揮發(fā)等因素引起殘留量的偏差，本試驗(yàn)對(duì)與速測(cè)儀檢測(cè)對(duì)照的3組樣品進(jìn)行殘留分析。結(jié)果如表2所示，色譜方法檢測(cè)青菜中殘留實(shí)測(cè)值分別為，毒死蜱在三檔添加水平下分別為0.093、0.49和4.9 mg·kg-1，三唑磷分別為0.088、0.45和4.7 mg·kg-1，實(shí)測(cè)值與添加值結(jié)果基本一致。

表2 9種速測(cè)儀對(duì)青菜提取液中添加毒死蜱和三唑磷后的抑制結(jié)果

注：+表示抑制率≥50%，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，-表示抑制率<50%，檢測(cè)結(jié)果為陰性。

根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2016，按蔬菜種類劃分青菜屬于普通白菜，其毒死蜱的最大殘留限量(MRL)為0.1 mg·kg-1；上述標(biāo)準(zhǔn)中未限定普通白菜中三唑磷的MRL，但規(guī)定結(jié)球甘藍(lán)和節(jié)瓜中三唑磷的MRL為0.1 mg·kg-1；因而本試驗(yàn)中設(shè)定青菜中毒死蜱和三唑磷的MRL均為0.1 mg·kg-1。按9種速測(cè)儀檢測(cè)結(jié)果顯示，在0.1和0.5 mg·kg-1(5倍MRL)添加水平的毒死蜱和三唑磷，9種市售速測(cè)儀均無(wú)法檢出陽(yáng)性；即使在5 mg·kg-1的添加水平下，僅有A和B能檢出毒死蜱的陽(yáng)性，三唑磷的陽(yáng)性略優(yōu)于毒死蜱，有3種速測(cè)儀能檢出陽(yáng)性，但仍有6種速測(cè)儀無(wú)法檢出這一添加濃度的三唑磷，說(shuō)明農(nóng)殘速測(cè)儀在篩查蔬菜中毒死蜱和三唑磷的靈敏度有待提升。

2.3 農(nóng)殘速測(cè)儀對(duì)緩沖鹽溶液中添加三唑磷和毒死蜱的靈敏度

9種市售農(nóng)殘速測(cè)儀對(duì)添加2種有機(jī)磷農(nóng)藥緩沖鹽溶液的靈敏度檢測(cè)時(shí)，分別以毒死蜱0.08和2.00 mg·L-1、三唑磷以0.30和0.50 mg·L-1的基準(zhǔn)濃度調(diào)整測(cè)試濃度。如表3所示，按照靈敏度的定義可得9種速測(cè)儀對(duì)緩沖鹽溶液中毒死蜱的靈敏度分別為0.06 mg·L-1(速測(cè)儀A)，0.06 mg·L-1(速測(cè)儀B)，>5 mg·L-1(速測(cè)儀C)，2.5 mg·L-1(速測(cè)儀D)，>5 mg·L-1(速測(cè)儀E)，>5 mg·L-1(速測(cè)儀F)，5 mg·L-1(速測(cè)儀G)，5 mg·L-1(速測(cè)儀H)，1.0 mg·L-1(速測(cè)儀I)。從9種速測(cè)儀對(duì)毒死蜱緩沖鹽溶液測(cè)試結(jié)果看，A、B屬于靈敏度高的第一梯隊(duì)，在0.06 mg·L-1附近，I、D、G和H屬于靈敏度第二梯隊(duì)，在1～5 mg·L-1，C、E和F靈敏度較差，已經(jīng)>5 mg·L-1。

各速測(cè)儀對(duì)緩沖鹽溶液三唑磷的靈敏度，A為0.20 mg·L-1，B為0.15 mg·L-1，C為0.15 mg·L-1，D為0.20 mg·L-1，E為0.15 mg·L-1，F(xiàn)為0.20 mg·L-1，G為0.30 mg·L-1，H為0.30 mg·L-1，I為2.50 mg·L-1·L-1。如表4所示，從9種速測(cè)儀對(duì)三唑磷緩沖鹽溶液測(cè)試結(jié)果看，A、B、C、D、E、F、G和H靈敏度較高，在0.15～0.30 mg·L-1，I靈敏度較差在2.5 mg·L-1左右。

表3 市售農(nóng)殘速測(cè)試劑盒對(duì)毒死蜱不同緩沖鹽溶液的抑制率結(jié)果

表4 市售農(nóng)殘速測(cè)試劑盒對(duì)三唑磷緩沖鹽溶液的抑制率結(jié)果

2.4 靈敏度評(píng)價(jià)方式的差異

目前對(duì)于農(nóng)殘速測(cè)儀靈敏度的評(píng)價(jià)存在提取液和蔬菜中農(nóng)殘含量2種方式，分別對(duì)應(yīng)mg·L-1和mg·kg-1兩個(gè)濃度。如根據(jù)NY/T 488—2001蔬菜上有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)方法規(guī)定，最低檢出濃度分為溶液和蔬菜2種類型。GB/T 5009.199—2003和食品快速檢測(cè)方法(KJ 201710)規(guī)定的檢測(cè)限為質(zhì)量濃度mg·kg-1。本試驗(yàn)中對(duì)于蔬菜和提取溶液靈敏度的差異來(lái)自兩部分。首先是單位的差異，由于在提取時(shí)按照2 g蔬菜樣品對(duì)應(yīng)10 mL提取液，假設(shè)提取完全，則提取液靈敏度(mg·L-1)× 10 mL/2 g≈蔬菜靈敏度(mg·kg-1)，即0.06 mg·L-1毒死蜱的提取液靈敏度對(duì)應(yīng)蔬菜的靈敏度為0.3 mg·kg-1，但實(shí)際上由于存在提取效率的問(wèn)題，蔬菜的實(shí)際靈敏度遠(yuǎn)大于5倍。

其次，快速檢測(cè)方法的提取液體系是緩沖鹽溶液-蔬菜中農(nóng)藥殘留。由于大多數(shù)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥是脂溶性的，難以溶于水，故而其提取效率較低[13-14]。根據(jù)PPDB的農(nóng)藥性質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://sitem.herts.ac.uk/aeru/ppdb/en/atoz.htm)中可查到，在20 ℃條件下，毒死蜱在純水中的溶解度為1.05 mg·L-1，三唑磷在純水中的溶解度為35 mg·L-1。加緩沖鹽后通常還會(huì)降低農(nóng)藥的溶解度。本試驗(yàn)在2 g青菜樣品中分別添加0.5 mg·kg-1毒死蜱和三唑磷，在10 mL緩沖鹽溶液提取后，分別對(duì)提取液和提取后的青菜樣品進(jìn)行色譜檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加毒死蜱在兩相中的殘留濃度分別為0.009和0.39 mg·L-1，三唑磷的分布分別為0.010和0.31 mg·kg-1，經(jīng)計(jì)算僅有10.3%的毒死蜱和13.9%的三唑磷能被緩沖鹽溶液提取，這就解釋了8種速測(cè)儀A、B、C、D、E、F、G和H對(duì)提取液靈敏度均在0.15～0.3 mg·L-1，但對(duì)于5 mg·kg-1三唑磷加標(biāo)的青菜樣品，沒(méi)有顯示為強(qiáng)陽(yáng)性卻反而為陰性的原因。由于緩沖鹽溶液對(duì)青菜的提取效率太低，但需要說(shuō)明的是，通常蔬菜中的農(nóng)藥殘留是在助劑溶解的農(nóng)藥產(chǎn)品施藥后殘留的，這些助劑和農(nóng)藥共同殘留在蔬菜表面，可能有助于緩沖溶液對(duì)農(nóng)藥的提取。另外不同蔬菜種類的葉片、葉片的剪碎程度、提取時(shí)間和提取溫度等因素都對(duì)速測(cè)法的靈敏度存在影響，但不可否認(rèn)的是，利用緩沖鹽溶液提取農(nóng)藥的能力太弱，不利于速測(cè)法在對(duì)蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)。

3 小結(jié)

目前市售的9種速測(cè)儀產(chǎn)品均不滿足對(duì)青菜中添加0.1和0.5 mg·kg-1毒死蜱和三唑磷的快速檢測(cè)，對(duì)于5 mg·kg-1毒死蜱的靈敏度僅有農(nóng)殘速測(cè)儀A和B能滿足檢測(cè)需要，5 mg·kg-1三唑磷的靈敏度僅有速測(cè)儀B、C、E能滿足需要。9種速測(cè)儀在毒死蜱緩沖鹽提取液的靈敏度差異明顯，分為0.06 mg·L-1，1～5 mg·L-1和>5 mg·L-1三檔，在三唑磷緩沖鹽溶液的靈敏度較為集中，8種試劑盒的靈敏度均在0.15～0.3 mg·L-1，1種試劑盒靈敏度為2.5 mg·L-1。農(nóng)殘速測(cè)儀利用緩沖鹽溶液提取效率僅為10.3%～13.9%，雖然受多種因素影響，但提取效率的事實(shí)無(wú)法改變。未來(lái)對(duì)于速測(cè)方法的改良，應(yīng)從添加洗滌劑或改變提取溶劑等方式以提高農(nóng)藥提取效率，從而優(yōu)化速測(cè)方法在蔬菜中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。