基于高通量測序技術的懷山藥與 菜山藥內生細菌多樣性比較

劉元，文春南，劉淼，李文，洪利亞，麻兵繼

(河南農業大學 農學院 中藥材系，河南 鄭州 450002)

山藥(DioscoreaoppositaThunb)為薯蕷科多年生草質藤本植物薯蕷的根莖[1]。懷山藥是指在古懷慶府地區(主要位于今河南焦作境內)種植的山藥，因其口味和療效俱佳，位列“四大懷藥”之一，是河南省著名道地藥材。研究表明，懷山藥含皂苷、黏液質、尿囊素、膽堿、山藥堿、淀粉、糖蛋白、多酚氧化酶、VC、氨基酸等成分，還含有硒、鐵、銅、鋅、錳、鈣等多種微量元素[2]。懷山藥有健脾、補肺、固腎、抗衰老、抗腫瘤、增強免疫機能、調節內分泌、心肺功能和神經系統等功能[3]，是我國傳統的藥食兩用大宗藥材之一。與懷山藥相對的是市場上銷售的菜山藥，菜山藥多種植于山東、山西和陜西等地區，雖同為山藥，但兩者外形上區別很大。懷山藥直徑一般為1.0～1.5 cm，但菜山藥則非常的粗壯，直徑能達到4～5 cm，且形狀不規則。一般認為，懷山藥的藥用價值和營養價值要遠高于菜山藥[4]，但關于懷山藥道地品質的形成機制尚不明確。

植物內生菌是指那些在生活史的部分或全部階段都生活在植物組織活細胞間隙而對植物沒有明顯傷害的一類微生物。近年來，隨著國內外內生菌研究熱度的不斷提升，中藥道地藥材內生菌的研究已成為一大熱點。研究表明，藥用植物內生菌不僅自身能獨立產生豐富的次級代謝產物，而且還能參與宿主的代謝過程，對有效成分的產生和積累起到很大的促進作用[5]。王曉龍等[6]從懷山藥的根中共分離得到41株內生菌，其中18株細菌，經鑒定為8個屬；另有23株真菌，經鑒定為6個屬[7]。張建新等[8]從懷山藥中分離得到32株內生菌，其中11株內生細菌對白菜軟腐菌具有拮抗性。趙龍飛[9]從懷山藥中分離得到34株內生菌，其中7株具有明顯的抑菌作用。另外，常江川[10]從懷山藥中分離得到65株金黃色葡萄球菌、32株大腸埃希菌。

高通量測序技術(high throughput sequencing，HTS)是近年來廣泛應用的分子生物學分析方法之一，該測序技術具有高通量、高靈敏度、高準確性和低運行成本的特點，可以深入、細致地研究微生物群落結構，從而克服由于傳統菌株分離培養的限制而導致很難獲得宿主植物完整內生菌譜的技術障礙，近年來已應用于多個中藥材道地性的研究[11]。本實驗采用Illumina二代高通量測序技術分別對懷山藥和菜山藥根莖中的內生細菌16S rDNA V4區域進行擴增和測序，進而對基因序列進行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類。在此基礎上分別對懷山藥和菜山藥內生細菌的群落組成進行分析，分析和比較兩者群落內的組織結構和群落間的差異。在門、綱、目、科、屬、種6個水平分析比較了懷山藥和菜山藥根莖中的內生細菌的群落組成，并從ChaoⅠ、Simpson和Shannon等生態指數和Rank-Abundance曲線方面分析對比了2種來源的山藥內生細菌群落內的物種豐富度和均度，為進一步研究懷山藥的品質形成提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品

懷山藥樣本系2016年10月采集于河南省焦作市溫縣懷山藥道地產區，選擇10株外觀健康的山藥植株，取其根莖，放入無菌樣品袋中，經河南農業大學中藥材系麻兵繼教授鑒定為鐵棍山藥。菜山藥系鄭州市超市購買。選擇2根外觀正常的菜山藥，放入無菌樣品袋中，2組樣品均放在4 ℃環境中保存，于12 h內進行表面消毒處理，樣品分別命名為Huai和Cai。

1.2 樣品表面消毒

將懷山藥根莖和菜山藥根莖表面用蒸餾水清洗干凈，然后用濾紙吸干表面水分。將2組樣品放入無菌操作臺中，紫外照射40 min，每隔10 min將樣品翻轉一次，再用75%(體積分數)的乙醇浸泡1～2 min，3%次氯酸鈉浸泡2～3 min，75%乙醇清洗30 s，最后用無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干表面水分。第5次沖洗的無菌水用移液槍吸取200 μL，用涂布器在PDA培養基上涂布，作為空白對照(CK)組，每個樣本空白組重復3次，觀察各個樣品CK組有無菌落產生，作為評判樣本表面是否消毒徹底的指標[12]。

1.3 樣本DNA提取與純化

使用環境樣本DNA提取試劑盒進行基因組DNA提取后，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA。

1.4 16S rDNA V4區域的PCR擴增

將提取的DNA進行適當稀釋作為模板，把合成的帶有Barcode的特異引物對樣本的16S rDNA V4區域進行PCR擴增，特異引物序列為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR采用高保真、高效率和高速PCR酶(TOYOBO公司的KOD-Plus-Neo DNA Polymerase)。每個樣本進行3次重復，每個PCR反應終止于線性擴增期，PCR結束后將同一樣本的PCR產物混合后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN公司)切膠回收PCR產物，TE緩沖液洗脫回收目標DNA片段，使用2%瓊脂糖電泳檢測，檢測條件為5 V·cm-1，20 min。然后將切膠回收的PCR產物送北京艾普希隆生物科技有限公司進行16S rDNA V4基因的測序分析(使用Illumina公司的MiSeq Reagent Kit v2測序試劑盒)。

1.5 生物信息學分析

測序得到的PE reads首先利用FLASH3進行拼接，同時對序列質量進行質控，在去除低質量堿基及接頭污染序列后，在97%的相似性水平上使用UPARSE算法7進行OTU的聚類，在使用Uchime 8去除嵌合體后，挑選出OTU的代表性序列。使用Greengene 10進行物種分類信息的劃分，同時去除注釋為葉綠體、線粒體以及非細菌或古菌界的OTU，并使用 FastTree12構建進化樹。去除在進化樹構建過程中被過濾掉的OTU，然后再使每個樣品的OTU具有相同的序列數。基于上述OTU的結果在群落組成(compositional)水平和系統發育(phylogenetic)水平上使用QIIME、Mothur和R等軟件對樣本進行群落內多樣性分析和群落間結構差異的分析。

2 結果與分析

2.1 樣本OTU代表序列聚類分析

采用classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并分別在各個分類學水平統計各樣本的群落組成。圖1～3分別表現了懷山藥和菜山藥內生細菌在門(phylum)、綱(class)和屬(genus)水平的群落結構和分類比較結果。從門水平來看，懷山藥和菜山藥的內生細菌兩者均主要分布在厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變性菌門(Proteobacteria)，兩者都存在有少量的芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠菌門(Chlorobi)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)和浮霉菌門(Planctomycetes)。值得注意的是，懷山藥的內生細菌要比菜山藥豐富，放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和裝甲菌門(Armatimonadetes)為懷山藥的特有真菌門。從綱水平來看，兩者內生細菌都主要分布在梭菌綱(Clostridia)、鞘脂桿菌綱(Sphingobacteriia)，但懷山藥的細菌群落組成比菜山藥的細菌群落組成更加豐富，其中酸微菌綱(Acidimicrobiia)、疣微菌綱(Spartobacteria)、擬桿菌綱(Bacteroidia)和厭氧繩菌綱(Anaerolineae)為懷山藥特有菌綱。從屬水平來看，懷山藥內生細菌主要分布在狹義梭菌屬(Clostridiumsensustricto1)、類似牙球菌屬(Blastocatella)，而菜山藥內生細菌則主要在Clostridiumsensustricto1這一屬水平，但在類似牙球菌屬中分布較少。另外，兩者在桿菌屬(Leadbetterella)、木洞菌屬(Woodsholea)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、土微菌屬(Pedomicrobium)和假單胞菌屬(Pseudomonas)等都有少量分布。因此，懷山藥內生細菌在多個層面上豐富度均大于菜山藥。

圖1 門水平上2種山藥內生細菌的分布

圖2 綱水平上2種山藥內生細菌的分布

圖3 屬水平上2種山藥內生細菌的比較

圖4 門水平上2種山藥內生細菌熱度圖分析

2.2 樣本Heatmap熱度圖分析

Heatmap用于表示一個或多個組的樣品在某一分類水平上的群落組成和豐度。豐度用顏色深淺來表征，顏色越偏紅，說明豐度越高，越偏藍色說明豐度越低，群落內既可根據豐度和組成進行聚類，也可按照特定的順序進行橫縱坐標的排列。從圖4可知，在門水平上，在懷山藥內生細菌主要分布的擬桿菌門(Bacteroidetes)在群落中的比例為31.8%，厚壁菌門(Firmicutes)為24.8%，變性菌門(Proteobacteria)為18.6%。菜山藥內生細菌中主要分布為厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)分別為38.3%、24.5%。從圖4中可以看出懷山藥群落組成要比菜山藥復雜，且放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、裝甲菌門(Armatimonadetes)為懷山藥特有菌門。從圖5可以看出，懷山藥內生細菌在屬水平上分別為Bacteroldetes(uncultured)、Proteobacteria(uncultured)、Gemmatimonadetes(uncultured)、Chlorobi(uncultured)、Acidobacteria(uncultured)、Chloroflexi(uncultured)、Firmicutes(uncultured)、Actinobacteria(uncultured)、Lentisphaerae(uncultured)、Armatimonadetes(uncultured)和Planctomycetes(uncultured)，而菜山藥分布最多的為Bacteroidetes(uncultured)屬。

圖5 屬水平上2種山藥內生細菌熱度圖分析

2.3 樣本進行系統發育分析

系統發育分析能夠揭示出生物進化關系的順序，進而可分析進化歷史及其相應的一些機制。系統發育分析的基礎是進行進化樹的構建，即通過選取某一類基因序列(此樣本選取的基因序列是16S rDNA V4區域)進行序列比對，根據序列間的堿基差異和序列特點選取合適的進化模型和構建方法來構建種水平進化樹。我們選取豐度最高的50個OTU與NCBI數據庫中基因序列進行比對，采用最大似然法構建發育樹(圖6)。從圖6可知，狹義梭菌Clostridiumsensustricto1在懷山藥和菜山藥分布均最多，豐度分別為75、130。懷山藥的特有菌有鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)、Variibactersp.、Planctomycessp.、Phreatobactersp.、Chthoniobactersp.、Arenimonassp.和假單胞菌(Pseudomonassp.)，而菜山藥中的特有菌為Burkholderiasp.、Rhodoplanessp.和Filimonassp.，在兩者中OTU豐度都很小，與上述分類分析的結果相吻合。

圖6 懷山藥和菜山藥內生細菌系統發育樹比較

2.4 樣本alpha多樣性分析

在群落生態學的研究中，物種多樣性包括了alpha-多樣性(群落內)、beta-多樣性(群落間)和gamma-多樣性(區域總多樣性)。通過樣本的alpha-多樣性分析可以反映微生物群落的物種豐度(Richness)和均勻性(Evenness)。alpha多樣性分析的分析指數有ChaoⅠ(估算物種豐富度)、Shannon(估算樣本中微生物多樣性)和Faith’s PD(估算物種豐富度)。分析指數結果如圖7所示。綜合三項指數分析可知，懷山藥內生細菌群落多樣性要高于菜山藥。

Observed代表觀測到的OTU數目，可用來和其他多樣性指標進行比較圖7 2種山藥內生細菌Alpha多樣性比較

Rank-Abundance曲線可用來解釋多樣性的2個方面，即物種多度和物種均勻度。構建方法是統計單一樣本中的每一個OTU所含的序列數，將OTU按豐度由大到小等級排序，再以OTU等級為橫坐標，以累積的序列豐度為縱坐標做圖。在水平方向，物種的多度由曲線的寬度來反映，曲線在橫軸上的范圍越大，物種的豐富度越高；曲線的形狀(平滑程度)反映了樣本中物種的均度，曲線越平緩，物種分布越均勻。由圖8可知，懷山藥的內生細菌要比菜山藥豐富，種群分布更加均勻，由于兩者的曲線都有較大斜率的變化，故兩者中都分布有優勢菌群。

圖8 2種山藥內生細菌Rank-Abundance曲線比較

3 討論

本實驗首次利用高通量測序技術對懷山藥和菜山藥根莖內環境中的細菌群落進行對比分析。實驗結果表明，懷山藥根莖內生菌的物種豐富度要高于菜山藥，且懷山藥內生菌分布更加均勻。在綱水平上懷山藥根莖中分布最多的為擬桿菌門(Bacteroidetes)細菌，所占比例為31.8%，其次為厚壁菌門(Firmicutes)細菌，所占比例為24.8%；而在菜山藥根莖中分布最多的為厚壁菌門(Firmicutes，38.3%)，其次為擬桿菌門(Bacteroidetes，24.5%)。懷山藥根莖中的特有菌門為Actinobacteria(2%)、Verrucomicrobia(0.6%)和Armatimonadetes(0.3%)。在屬水平上，兩者中分布最多的均為Clostridiumsensustricto1菌屬，在懷山藥和菜山藥中都存在Blastocatella、Leadbetterella、Woodsholea木洞菌屬、Acinetobacter不動桿菌屬、Pedomicrobium土微菌屬、Pseudomonas等7種菌屬細菌。經比較分析確定革蘭氏陰性棒狀桿菌(Sphingomonassp.)、Variibactersp.、浮霉狀菌(Planctomycessp.)、Phreatobactersp.、Chthoniobactersp.、Arenimonassp.、假單胞菌(Pseudomonassp.)為懷山藥的特有菌，而菜山藥中的特有菌為Burkholderiasp.、Rhodoplanessp.和Filimonassp.。本文首次比較系統地對懷山藥和菜山藥內生細菌的分布情況進行對比分析，為懷山藥道地性研究提供了一定的基礎。