提高大腸桿菌高密度發酵可溶性表達量研究

王肖彬 安登坤 劉洋

摘 要：目的：提高外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達量。方法：采用大腸桿菌K12菌株，含有表達某種抗體類蛋白的表達質粒，通過在發酵過程中加入甲硫氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的方式，檢測不同發酵時間表達量變化情況，評估每種物質對于目的蛋白在大腸桿菌中可溶性表達的影響。結果：同時加入甲硫氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的發酵批次可溶性蛋白表達量最高。結論：說明在大腸桿菌高密度發酵過程中加入甲硫氨酸、亮氨酸和異亮氨酸有助于提高目的蛋白的可溶性表達。

關鍵詞：大腸桿菌；高密度發酵；甲硫氨酸；亮氨酸；異亮氨酸；可溶性表達

DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2018.17.032

大腸桿菌是目前常用的蛋白發酵菌體，采用高密度發酵技術（High cell density cultivation， HCDC）不僅可以減少培養體積、提高目的蛋白產量，還可以縮短生產周期，減少設備投資從而降低生產成本，能極大地提高在市場上的競爭力[1]。但外源蛋白在獲得高水平表達的同時，容易形成包涵體，包涵體中的多肽鏈折疊錯誤，沒有活性，必須通過復雜的復性過程才能獲得功能正常的蛋白，但成功率低[2]，特別是含二硫鍵較多的包涵體蛋白，在復性過程中容易發生二硫鍵的錯配，從而使蛋白質失去生物學活性。蛋白的可溶性表達則可避免變、復性過程，明顯簡化后續純化工藝，保證功能蛋白的功能。因此，探索外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達具有較高的學術價值和廣泛的應用前景。

目前針對于高密度發酵過程中蛋白可溶性表達的研究主要停留在對大腸桿菌宿主細胞[3]、比生長速率、誘導時機[4]、誘導溫度[5]、培養基成分[6]、碳源種類[7]、表達載體啟動子[8]、融合標簽[9]等。關于發酵過程中補入氨基酸對可溶性蛋白表達的影響，國內目前的相關研究報道偏少。國外研究表明，在大腸桿菌表達蛋白期間，正亮氨酸殘基的引入會導致正常合成的蛋白結構或功能改變[10]，引起可溶性蛋白表達量的降低。在發酵過程中，補入甲硫氨酸，可以確保細胞獲得過量的甲硫氨酸，從而減少了甲硫氨酰tRNA不正確的加載正亮氨酸的概率。甲硫氨酸的加入可以抑制正亮氨酸的作用[11]，從而維持菌體蛋白合成的正常結構和功能。亮氨酸可以抑制酶參與正纈氨酸和正亮氨酸的合成，但是，亮氨酸同樣影響細胞功能造成發酵結束時的細胞密度偏低。額外加入的異亮氨酸，則可以極大得增加重組蛋白產量[12]。其他防止正亮氨酸錯誤滲入細胞蛋白的方式還有刪除亮氨酸操縱子等[13]。

本文利用我公司現有的含有抗體質粒的大腸桿菌K12菌株，通過在發酵過程中分別加入甲硫氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，觀察對于目的蛋白可溶性表達量的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑

甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鉀、硫酸銨購自國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖購自西王藥業有限公司；胰蛋白胨和酵母粉購自OXOID公司。

1.2 主要儀器

Bioflo415型發酵罐為NBS公司產品；電子天平為北京賽多利斯儀器有限公司產品；pH電極、溶氧電極為Pall公司產品；高速冷凍離心機為長沙市鑫奧儀器有限公司產品；電泳儀為Bio-Rad公司產品；AKTA純化系統為GE公司產品。

1.3 發酵方法

將保存于-70℃的大腸桿菌K12菌株轉種到LB培養基中，按0.2%接種量轉種，30℃，150r/min，過夜培養后作為一級種子。將一級種子按10%的接種量接種發酵罐，調節維持溶氧30%以上，pH7.0±0.3左右，溫度30°C，培養時間約50 h。在OD550=40時分別補入終濃度為21mmol/L的甲硫氨酸、終濃度為12mmol/L的亮氨酸和終濃度為15mmol/L的異亮氨酸。不加入各種氨基酸的作為對照批次。發酵過程中測量菌液OD550，每隔5h取發酵液離心，收集菌體，稱取計量不同時間點的菌體濕重。

1.4 表達量檢測方法

取上述菌體15g進行超聲破碎，將超聲后菌液離心，取上清，利用Protein G色譜柱，檢測可溶性蛋白表達量。

2 結果

2.1 可溶性蛋白表達量

三種氨基酸同時補入的發酵批次可溶性表達量最高。補入甲硫氨酸和異亮氨酸的發酵批次與只補加異亮氨酸的發酵批次可溶性表達量接近，均高于對照批次。補入甲硫氨酸的發酵批次、補入亮氨酸和異亮氨酸的發酵批次可溶性表達量與對照批次相近。補入甲硫氨酸和亮氨酸的發酵批次與只補加亮氨酸的發酵批次表達量均明顯低于對照批次。結果見圖1。

2.2 下罐菌體濕重

以上幾批發酵菌體，補入甲硫氨酸和亮氨酸的發酵批次菌重較低，10L發酵液收得950g菌，補入亮氨酸的發酵批次下罐菌體濕重最小，10L發酵液僅收得880g菌。其余批次菌體濕重相近，均在1.2kg左右。結果見表1。

3 討論

高密度發酵是在保證生長速率的前提下，盡可能提高細胞密度，使體積生產率大幅提高[14]。在大腸桿菌高密度發酵過程中，減少包涵體形成和提高蛋白可溶性表達，有助推動基因工程蛋白藥物生產的發展和技術進步。

本文通過一系列實驗比對，清晰反映出幾種氨基酸在大腸桿菌發酵可溶性蛋白表達過程中發揮的不同作用。亮氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸均加入的發酵批次可溶性蛋白表達量要明顯高于只加入甲硫氨酸和異亮氨酸的發酵批次，說明亮氨酸的加入有助于提高可溶性蛋白表達量。但同時，只加入亮氨酸的發酵批次其表達量是7批發酵批次中最低的，結合其對下罐菌量的影響，不難看出，亮氨酸會影響正常的細胞功能，造成細胞密度偏低。只加入甲硫氨酸和亮氨酸的發酵批次其可溶性蛋白表達量和菌量也低于對照批次，且明顯低于同時加入三種氨基酸的發酵批次，說明異亮氨酸的加入可以抑制亮氨酸對細胞密度產生的不良影響。只加入亮氨酸和異亮氨酸的發酵批次其表達量與對照批次相近，再引入甲硫氨酸后表達量有了明顯提升，說明在發酵過程中補入甲硫氨酸，確保細胞可以獲得過量的甲硫氨酸，可以保護目標蛋白的正常結構和功能特性，提高可溶性蛋白表達量。

從圖1中可以看出，在發酵25-30h，蛋白表達初期，不同批次發酵菌體可溶性蛋白表達量即出現明顯區分，發酵后期表達量變化不大。說明可溶性蛋白表達的關鍵時間在于表達初期，一旦目的蛋白過多得錯誤折疊形成包涵體，在發酵后期很難再提高目的蛋白的可溶性表達量。因此，幾種氨基酸應在發酵前期、目的蛋白表達前進行補加。

通過以上實驗分析，我們可以得出如下結論：在發酵前期加入亮氨酸有助于提高可溶性蛋白表達量，但同時會對細胞功能產生影響，造成菌體密度偏低；異亮氨酸則可以拮抗亮氨酸對細胞密度產生的不利影響；甲硫氨酸的加入可以明顯增加可溶性蛋白表達量，與上述兩種氨基酸一起協同作用的效果最優。

綜上所述，在大腸桿菌高密度發酵前期同時補入甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸，有助于提高目的蛋白的可溶性表達量。

參考文獻：

[1]李民，陳常慶.重組大腸桿菌高密度發酵研究進展[J].生物工程進展，2000，20（02）：26-31.

[2]劉爽，胡寶成.原核系統可溶性表達策略[J].生物技術通訊，2005，16（02）：172-175.

[3]劉啟剛，代云見，張勇俠等.抗IgE單鏈抗體在大腸桿菌中可溶性高效表達條件的研究[J].中國生物工程雜志，2012，32（11）：23-28.

[4]朱紅裕，李強.外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達策略[J].過程工程學報，2006，6（01）：150-155.

[5]王園園，王金鳳，蔡欣等.重組人KGF-2的制備及生物學活性研究[J].軍事醫學科學院院刊，2008，32（01）：34-38.

[6]余波，程安春，汪銘書.大腸桿菌中重組蛋白可溶性表達的研究進展及展望[J].黑龍江畜牧獸醫，2008（10）：19-20.

[7]楊彩云，杜慈，黃平等.重組AiiA蛋白可溶性表達及發酵條件優化[J].江西農業大學學報，2011，33（06）：1219-1227.

[8]李振國，徐明波，牛罡.在大腸桿菌周質表達重組蛋白的研究進展[J].藥物生物技術，2011，18（01）：73-76.

[9]吳珊珊，朱蕓，陳珊珊等.融合標簽在蛋白質可溶性表達中的應用進展[J].化工進展，2014，33（04）：993-998.

[10]M·K·萊爾德，K·維拉瓦力.用于防止正亮氨酸錯誤地摻入蛋白質中的方法和組合物[P].中國專利：201380048535.X，2015-05-27.

[11]Nurit Bar-Nun，Alfred M.Mayer. Efferct of norleucine on growth，protein and catechol oxidase synthesis in tobacco suspension cultures[J].Phytochemistry，1985，24（10）：2161-2166.

[12]Macdonald，Andrew，C.，Abu-Absi，Nicholas，Inlow，Duane，et al.Preventing nor-valine and norleucine misincorporation in recombinant proteins[P].US Patent：2007005963，2007-09-13.

[13]Papaneophytou P，Kontopidis G.Statistical approaches to maximize recombina-nt protein expression in Escherichia coli：A general review[J].Protein Expression and Purification，2014（94）：22-32.

[14]謝萌，徐鑫，咸漠等.重組大腸桿菌高密度發酵產甲羥戊酸動力學[J].生物加工過程，2015，13（06）：70-74.