慢性自發(fā)性蕁麻疹患者外周血IL-35水平檢測(cè)及其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的抑制作用

錢 青 高春巖 申宇鴻 宋世珅 于建秀 于月紅

慢性自發(fā)性蕁麻疹(chronic spontaneous urticaria，CSU)是一種常見(jiàn)的皮膚疾病，其特征是持續(xù)6周以上、反復(fù)出現(xiàn)皮膚風(fēng)團(tuán)伴瘙癢[1]。異常活化的肥大細(xì)胞(mast cells，MC)可釋放組胺等炎癥介質(zhì)到組織和/或血管系統(tǒng)中，擴(kuò)張血管及增加血管滲透性，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule，VCAM-1)等黏附分子，加重炎性反應(yīng)[2]。近期研究表明，白細(xì)胞介素-35(Interleukin，IL-35)可發(fā)揮免疫抑制作用，但關(guān)于其對(duì)CSU患者血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的作用則缺乏研究。本次研究通過(guò)檢測(cè)CSU患者外周血中IL-35與VCAM-1濃度；并經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)用CSU患者血清與肥大細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液活化血管內(nèi)皮細(xì)胞，分析IL-35對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1活化的抑制作用，探討IL-35在慢性自發(fā)性蕁麻疹疾病過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2017年1月至2018年3月在北京市和平里醫(yī)院新診斷的CSU患者30例，并收集30名體檢中心體檢人群作為健康對(duì)照組(HC)。納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2014年中國(guó)蕁麻疹診療指南[3]收集CSU患者入組，并根據(jù)蕁麻疹病情活動(dòng)評(píng)分(Urticaria disease activity score，UAS)評(píng)估病情嚴(yán)重程度。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有其他皮膚過(guò)敏性疾病、高血壓、糖尿病、腎臟疾病、慢性感染性疾病、腫瘤、自身免疫性疾病、服用抗組胺藥物、凝血調(diào)節(jié)藥物(如阿司匹林)等、近期服用免疫抑制劑或行抗感染治療，合并其他病毒感染。兩組患者年齡、性別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性(見(jiàn)表1)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)06/2017)，征得參加者監(jiān)護(hù)人知情同意。

表1 研究對(duì)象研究資料

1.2 儀器和試劑 異硫氰酸熒光素(FITC)-鼠抗人VCAM-1單克隆抗體(mAb)、紅細(xì)胞裂解液及流式細(xì)胞分析儀均購(gòu)自美國(guó)BD 公司。人肥大細(xì)胞(HMC-1)購(gòu)自上海信裕生物科技公司。RPMI 1640培養(yǎng)液、M199培養(yǎng)液及胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco。細(xì)胞因子IL-35及sVCAM-1試劑購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司。鈣黃綠素購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 患者治療前采集靜脈血3 mL，離心收集血清，儲(chǔ)存在-80℃，用于檢測(cè)IL-35、sVCAM-1濃度和體外實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 根據(jù)UAS評(píng)估病情嚴(yán)重程度，皮膚風(fēng)團(tuán)直徑<3 cm，數(shù)量<10個(gè)，0分；10～50個(gè)直徑<3 cm的小風(fēng)團(tuán)或10個(gè)以下直徑≥3 cm的大風(fēng)團(tuán)，1分；50個(gè)以上直徑<3 cm小風(fēng)團(tuán)或者10～50個(gè)直徑≥3 cm的大風(fēng)團(tuán)，2分；風(fēng)團(tuán)幾乎累及全部軀體，3分。瘙癢程度：無(wú)瘙癢，0分；輕度瘙癢，1分；中度瘙癢，2分；重度瘙癢，3分。UAS評(píng)分總分為0～6分，0～2分為輕度，2～4分為中度，4～6分為重度。

1.3.3 外周血IL-35和sVCAM-1檢測(cè) 對(duì)儲(chǔ)存于-80℃的血清進(jìn)行復(fù)溶，避免反復(fù)凍融，利用Luminex液相芯片檢測(cè)IL-35和sVCAM-1濃度，每個(gè)標(biāo)本檢測(cè)3次，取均值。

1.3.4 肥大細(xì)胞培養(yǎng)上清液制備 用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸混勻HMC-1細(xì)胞，終濃度為2×105/mL，取500 μL接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入100 μL患者或健康對(duì)照者血清，在37℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集上清液，用于體外實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 人靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 取健康孕婦分娩時(shí)的臍帶，用0.25%胰蛋白酶分離人靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，接種于含10%FBS的M199完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合狀態(tài)后，選取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。上述培養(yǎng)的HUVECs分5組：空白對(duì)照組(僅含RPMI 1640培養(yǎng)液)、健康人上清液組(HC)、CSU上清液組(CSU)、HC+IL-35組、CSU+IL-35組，HC及CSU上清液組加入20%(v/v) MC上清液，HC+IL-35、CSU+IL-35上清液組加入20 ng/mL IL-35和20%(v/v)MC上清液，培養(yǎng)24 h后，PBS洗滌二次，用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇IL-35濃度 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇IL-35實(shí)驗(yàn)濃度，IL-35終濃度分別為5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL與CSU培養(yǎng)上清液共培養(yǎng)(n=5)，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1表達(dá)。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUVECs VCAM-1表達(dá) 上述細(xì)胞，用100 μL PBS緩沖液重懸，加入10 μL FITC-鼠抗人VCAM-1，室溫環(huán)境下避光孵育30 min，PBS洗滌二次，并用400 μL PBS緩沖液重懸，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUVECs VCAM-1陽(yáng)性百分率。

1.3.8 熒光檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞 抽取健康人外周血10 mL，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，取白膜層，PBS洗滌二次，置37℃溫育1 h，去除懸浮細(xì)胞，調(diào)整濃度至3×105/mL，加入5 μmol/L鈣黃綠素，37℃溫育30 min。上述經(jīng)MC上清液和IL-35刺激培養(yǎng)的HUVECs，每孔加入鈣黃綠素標(biāo)記好的健康人PBMCs，37℃溫育20 min。吸去上清及未黏附的細(xì)胞，PBS洗孔2次，熒光顯微鏡下拍照。最后，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，吸取裂解液，用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 CSU患者血清IL-35和sVCAM-1濃度檢測(cè) 與HC組相比，CSU患者組血清IL-35濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HC組相比，CSU患者組血清sVCAM-1濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1a、b。

2.2 CSU患者血清IL-35和sVCAM-1相關(guān)性分析 CSU患者血清IL-35和sVCAM-1濃度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.5232，P=0.003)。見(jiàn)圖2。

2.3 CSU患者血清IL-35和sVCAM-1與臨床癥狀評(píng)分相關(guān)性分析 CSU患者血清IL-35濃度和CSU臨床癥狀評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.5406，P=0.0020)；血清sVCAM-1濃度與CSU臨床癥狀評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.4883，P=0.0062)。見(jiàn)圖3a、b。

2.4 預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇IL-35濃度 通過(guò)FCM法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1表達(dá)，IL-35在濃度為20 ng/mL時(shí)，對(duì)VCAM-1的抑制作用明顯，選擇20 ng/mL進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖4。

圖1 1a：CSU患者血清sVCAM-1濃度；1b：CSU患者血清IL-35濃度圖2 血清IL-35和sVCAM-1相關(guān)性分析

圖3 3a：血清IL-35與USA評(píng)分相關(guān)性分析；3b：sVCAM-1濃度與USA評(píng)分相關(guān)性分析 圖4 IL-35濃度梯度分析

2.5 IL-35對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1表達(dá)的抑制作用 與空白對(duì)照組相比，CSU上清液組內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1表達(dá)陽(yáng)性率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CSU上清液組相比，IL-35+CSU上清液組內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1表達(dá)陽(yáng)性率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與空白對(duì)照組相比，HC上清液組內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；流式分析見(jiàn)圖5a，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5b。

2.6 IL-35對(duì)單個(gè)核細(xì)胞黏附血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑制作用 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組少量單個(gè)核細(xì)胞黏附于HUVECs(圖6a)，CSU上清液組單個(gè)核細(xì)胞黏附顯著增加(圖6b)，IL-35+CSU上清液組與CSU上清液組相比，單個(gè)核細(xì)胞黏附顯著降低(圖6c)；通過(guò)熒光分光光度計(jì)檢測(cè)，與空白對(duì)照組相比，CSU上清液組熒光強(qiáng)度顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CSU上清液組相比，IL-35+CSU上清液組熒光強(qiáng)度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果見(jiàn)圖6d。

圖5 5a:FCM檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1表達(dá);5b:VCAM-1陽(yáng)性率比較

圖6 6a：空白對(duì)照組；6b：CSU上清液組；6c：IL-35+CSU上清液組

*P<0.05，CSU上清液組vs空白組；**P<0.05，CSU上清液+IL-35組vs CSU上清液組

圖6 6d HUVECs與單個(gè)核細(xì)胞黏附熒光強(qiáng)度比較

3 討論

慢性自發(fā)性蕁麻疹是一種常見(jiàn)的皮膚病，發(fā)病率為0.5%～1%[4]，特點(diǎn)是瘙癢、血管性水腫或兩者同時(shí)存在≥6周，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，加重患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5，6]。CSU發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及自身免疫、自身過(guò)敏和凝血異常等因素。目前抗組胺藥仍是CSU的基礎(chǔ)用藥，1代抗組胺藥受體選擇性差，長(zhǎng)期用藥對(duì)患者學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力有一定的影響，2代抗組胺藥不良反應(yīng)少，是目前國(guó)內(nèi)外推薦的一線藥物，但針對(duì)常規(guī)劑量控制不好的患者，需加大劑量最高至常規(guī)劑量的四倍，對(duì)患者生理心理造成一定的影響[7]。因此，迫切需要找到新的治療方法。

血管內(nèi)皮細(xì)胞異常活化是慢性自發(fā)性蕁麻疹疾病的主要機(jī)制。肥大細(xì)胞活化內(nèi)皮細(xì)胞，高表達(dá)血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)等黏附分子，促進(jìn)炎癥細(xì)胞黏附，聚集的白細(xì)胞釋放氧自由基、炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子等直接損傷內(nèi)皮細(xì)胞，從而加重炎性反應(yīng)。細(xì)胞表面VCAM-1和ICAM-1脫落形成可溶性粘附分子(如sVCAM-1和sICAM-1)，可作為內(nèi)皮功能障礙的生物標(biāo)志物[8]。本次研究發(fā)現(xiàn)CSU患者血清sVCAM-1濃度升高，且與CSU臨床癥狀評(píng)分呈正相關(guān)，表明CSU患者血管內(nèi)皮細(xì)胞活化參與疾病過(guò)程。

IL-35 是由p35和EBI3兩個(gè)亞單位組成的異源二聚體，屬IL-12細(xì)胞因子家族成員，具有免疫調(diào)節(jié)作用[9]，可促進(jìn)誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)增殖，抑制Th17細(xì)胞免疫反應(yīng)，發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)[10]。本次研究發(fā)現(xiàn)，CSU患者外血清細(xì)胞因子IL-35濃度降低，且和CSU臨床癥狀評(píng)分、血清sVCAM-1濃度呈負(fù)相關(guān)。與本次研究一致的是，郭敏等[11]用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)CSU患者外周血，發(fā)現(xiàn)CSU患者組血清IL-35濃度明顯低于健康對(duì)照組，而IL-17濃度明顯高于健康對(duì)照者。

為了進(jìn)一步闡明IL-35對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的抑制作用，本次研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)建立CSU患者活化的內(nèi)皮細(xì)胞模型。首先將患者血清(20%，v/v)直接活化血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VCAM-1表達(dá)，并與健康對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(數(shù)據(jù)未顯示)，CSU患者血清與肥大細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液可顯著誘導(dǎo)人HUVECs細(xì)胞高表達(dá)VCAM-1。與本次研究一致的是，Bossi等[12]證實(shí)，以CSU患者血清培育的MC細(xì)胞懸液可明顯增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，此機(jī)制不依賴于IgE和IgG。上述結(jié)果均表明CSU患者血清可活化肥大細(xì)胞，分泌活性物質(zhì)，進(jìn)而活化血管內(nèi)皮細(xì)胞。

CSU患者血清誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放介質(zhì)活化血管內(nèi)皮細(xì)胞可能有下列機(jī)制：首先，30%～40%CSU患者存在自體血清皮膚試驗(yàn)陽(yáng)性[13]；用含抗FcεR Iα自身抗體的血清孵育肥大細(xì)胞(MC)，可使MC脫顆粒釋放組胺、白三烯，合成和釋放前列腺素(PG-)D2，血栓素，白三烯(LT)和血小板活化因子(PAF)，這些介質(zhì)舒張血管，增加血管通透性和刺激皮膚感覺(jué)神經(jīng)末梢，從而導(dǎo)致皮膚腫脹、發(fā)紅和發(fā)癢[14]。其次，CSU患者血清內(nèi)存在非自身抗體類循環(huán)組胺釋放因子。另外，凝血途徑激活可促進(jìn)一些血管活性物質(zhì)釋放和形成，尤其是組胺和凝血酶，它們可以通過(guò)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞和肥大細(xì)胞脫顆粒而增加血管通透性[15]。

本次研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)IL-35可抑制CSU患者血清與MC共培養(yǎng)的上清液對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的活化作用。與此一致的是，通過(guò)熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，IL-35可抑制MC上清液誘導(dǎo)的單個(gè)核細(xì)胞黏附。有研究表明，IL-35在敗血癥小鼠模型中，可抑制脂多糖(LPS)活化內(nèi)皮細(xì)胞，其機(jī)制是通過(guò)活化細(xì)胞 MAPK-AP-1 信號(hào)通路，從而減少血管炎癥反應(yīng)[16]。

綜上所述，本次研究表明， CSU患者血清IL-35濃度顯著減低， sVCAM-1濃度升高。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CSU患者血清與MC共培養(yǎng)的上清液可活化血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的表達(dá)，而IL-35可抑制此活化過(guò)程。上述結(jié)果表明CSU患者IL-35濃度降低參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1活化。因此，通過(guò)調(diào)控CSU患者血清IL-35水平，對(duì)肥大細(xì)胞活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，從而為蕁麻疹的治療提供幫助。但本次研究臨床樣本量稍偏少，后續(xù)研究將進(jìn)一步探究IL-35對(duì)肥大細(xì)胞活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。