葡萄籽原花青素對中波紫外線誘導HaCaT細胞氧化損傷的保護作用

李桂雙 卜潔瓊 龍劍文

過度的日光照射所引起的皮膚疾患和皮膚老化在皮膚科門診中占據相當的比例[1,2]。紫外線(UV)輻射所導致的氧化應激損傷是引發皮膚光老化，光損傷的重要因素[3]，角質形成細胞是構成人表皮的主要細胞，而中波紫外線(UVB)主要作用于皮膚表皮，引起角質形成細胞氧化損傷和細胞凋亡[4]。葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidin extract, GSPE)是從葡萄籽中提取的一類化合物，具有良好的清除自由基和抗氧化活性，以及廣泛的細胞保護作用[5]。葡萄籽原花青素作為一種營養補劑已被廣泛使用，目前證實其能有效清除機體內自由基，改善運動代謝、提高耐缺氧能力，具有抗疲勞、提高運動能力的功能[6]。但葡萄籽原花青素對紫外線引起的人角質形成細胞氧化損傷是否具有保護作用，目前還不清楚。因此，本文以HaCaT 細胞系為基礎，觀察了葡萄籽原花青素對UVB輻射誘導的人角質形成細胞氧化損傷的保護作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 UVB輻照儀為德國Waldmann Medizintechnik公司生產，輻射波長為280～320 nm，工作強度為1.35 mW/cm2，采用TN2340紫外線強度檢測儀(臺灣泰納)測量核實。葡萄籽原花青素(純度≥95%)購自天津市尖峰天然產物研究開發有限公司。HaCaT細胞株購于武漢大學中國典型培養物保藏中心。0.25%胰酶、DMEM培養基、胎牛血清購于美國Gibco公司。CCK-8試劑盒購于日本同仁化學公司。Hoechst 33258為美國Sigma公司產品。Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒均購于上海碧云天生物技術有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)活力測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力測試盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。活性氧簇(ROS)探針DCFH-DA購于北京索萊寶科技有限公司；Rhodamine 123為美國Invitrogen 公司產品。Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3抗體、辣根酶標記抗兔lgG抗體購于Cell signal technology公司。辣根酶標記的β-actin抗體為上海興悠生物科技有限公司產品。ECL試劑盒為Amersham Biosciences公司產品。3111型細胞培養箱購于美國熱電公司；BD FACSCanto II型流式細胞儀購于美國BD FACScan 公司。

1.2 試劑配制與實驗分組 二甲基亞砜(DMSO)稀釋制備葡萄籽原花青素工作溶液，DSMO終體積分數<0.1%，實驗分為5組：正常對照組，UVB組，葡萄籽原花青素低濃度組(UVB+50 μg/mL GSPE)，葡萄籽原花青素中濃度組(UVB+100 μg/mL GSPE)，葡萄籽原花青素高濃度組(UVB+200 μg/mL GSPE)。

1.3 實驗方法

1.3.1 各實驗組處理方法 各組紫外線照射劑量為30 mJ/cm2[7]。將生長至80%融合的HaCaT細胞傳代于細胞培養皿中，每組設立6個平行孔。葡萄籽原花青素各濃度組處理方法：UVB照射前，先將不同濃度的葡萄籽原花青素加入培養皿與對數生長期HaCaT細胞于培養箱中共同培養24 h，洗滌細胞，避光處打開平皿蓋，并予以UVB輻射，加入新鮮培養液繼續培養12 h，收集細胞或上清，檢測相關項目；UVB組：取對數生長期HaCaT細胞于培養箱繼續培養24 h，洗滌細胞，避光打開平皿蓋，并予以UVB輻射，加入新鮮培養基，繼續培養12 h，收集細胞或上清，檢測相關項目；正常對照組：取對數生長期HaCaT細胞于培養箱正常培養對照。實驗重復三次。

1.3.2 葡萄籽原花青素對HaCaT細胞增殖活力的影響 實驗分為空白對照組，試驗對照組(葡萄籽原花青素0 μg/mL劑量組)，試驗組(葡萄籽原花青素50 μg/mL劑量組、葡萄籽原花青素100 μg/mL劑量組、葡萄籽原花青素200 μg/mL劑量組、葡萄籽原花青素400 μg/mL劑量組、葡萄籽原花青素800 μg/mL劑量組)。將生長至80%融合的HaCaT細胞傳代于細胞培養皿中，每組設立6個平行孔，常規培養24 小時后，洗滌細胞，試驗對照組和各試驗組中加入CCK-8 10 μL，顯色后，以各孔450 nm 波長的吸光值(Absorbance，A)顯示細胞的存活數量。細胞的存活率(%)=[(A1-A3)/(A2-A3)]×100%。 A1～A3分別為試驗組、試驗對照組、空白對照組A值。實驗重復三次。

1.3.3 LDH、SOD、GSH-Px活性及MDA含量檢測 各組HaCaT細胞處理后，收集各組細胞或上清，根據試劑盒說明書進行相關操作，分光光度計測量光密度值，根據說明書公式，計算各組LDH、SOD、GSH-Px和 MDA的活力或含量。

1.3.4 細胞凋亡檢測 各組HaCaT細胞處理后，消化，洗滌，收集細胞，制備細胞懸液，冰浴避光中操作如下：采用結合緩沖液懸浮細胞，使其濃度為5×104/L，后加入Annexin-FITC和PI，共同孵育15 min染色，1 h內，流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。實驗重復三次。

1.3.5 細胞凋亡形態的觀察 制備HaCaT細胞懸液，調整密度為109個/L，接種于6孔培養板中。進行相關處理后，收集細胞并洗滌，4%多聚甲醛溶液固定后，PBS洗滌，Hoechst33258染色15 min。采用熒光顯微鏡觀察細胞形態變化，并照相保存結果。實驗重復三次。

1.3.6 葡萄籽原花青素對HaCaT細胞內ROS和線粒體膜電位水平的影響 各組HaCaT細胞處理后，消化，洗滌，收集細胞，制備細胞懸液。葡萄籽原花青素對HaCaT細胞內ROS水平的影響：各組加入ROS探針DCFH-DA 10 μmol/L，共同孵育60 min，PBS洗滌3次，消化，重懸細胞，流式細胞儀檢測。將處理后細胞，熒光顯微鏡觀察拍照。細胞內線粒體膜電位水平的檢測：各組加入羅丹明123 1 mmol/L，共同培養30 min，重懸細胞，上機檢測線粒體膜電位變化并記錄。實驗重復三次。

1.3.7 Western blotting檢測蛋白表達 各組HaCaT細胞處理后，消化，洗滌，收集細胞，提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量檢測，上樣，采用SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，PBS洗膜，5%脫脂牛奶封閉l h；洗膜后加入一抗；4℃過夜；PBS洗膜；加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育0.5 h；洗膜；增強化學發光試劑盒處理。結果用Quantity one圖像分析軟件光密度分析，用各目的蛋白灰度值與β肌動蛋白灰度值的比值代表各檢測蛋白的相對表達量。實驗重復三次。

2 結果

2.1 不同濃度葡萄籽原花青素對HaCaT細胞增殖活力的影響 與正常對照組比較(98.04±1.28)%，50 μg/mL GSPE組、100 μg/mL GSPE組、200 μg/mL GSPE組HaCaT細胞增殖活力無明顯差異(存活率分別為(96.57±1.09)%、(96.54±1.46)%、(96.01±1.60)%，且四組組間比較差異無統計學意義(F=2.422，P=0.096)。而400 μg/mL GSPE組、800 μg/mL GSPE組，HaCaT細胞存活率分別為(91.00±3.65)%、(82.69±2.27)%，較正常對照組明顯降低(F=58.570,P=0.000)。因此，選定葡萄籽原花青素的工作濃度為50 μg/mL，100 μg/mL，200 μg/mL。

2.2 葡萄籽原花青素處理抑制了UVB輻射誘導的HaCaT細胞凋亡 在工作濃度范圍內，葡萄籽原花青素對由UVB誘導的HaCaT細胞凋亡有明顯抑制作用。比較正常對照組，在UVB組中，HaCaT細胞凋亡率顯著增加(t=32.900,P=0.000)，說明UVB輻射能誘導HaCaT細胞凋亡。比較UVB組，在葡萄籽原花青素低濃度組、葡萄籽原花青素中濃度組、葡萄籽原花青素高濃度組中，HaCaT細胞凋亡率漸減少，且組間比較，差異有統計學意義(F=105.067,P=0.000)(圖1a)。同時，Hoechst 33258染色后，熒光顯微鏡下觀察顯示，存活HaCaT細胞胞核為橢圓形，顯示為較暗的均一藍色；而凋亡HaCaT細胞染色質凝聚，表現為亮藍色(圖1b)。圖中結果表明，與正常對照組比較，UVB輻射后，凋亡細胞顯著增加，而葡萄籽原花青素的處理抑制了UVB輻射誘導的細胞凋亡。

注：1：正常對照組，2：葡萄籽原花青素高濃度組，3：葡萄籽原花青素中濃度組，4：葡萄籽原花青素低濃度組，5：UVB組。#：對比UVB組，P<0.01，*：P<0.01

圖1 葡萄籽原花青素抑制UVB輻射誘導的細胞凋亡(×400)

2.3 葡萄籽原花青素對UVB輻射條件下HaCaT細胞ROS水平的影響 DCFH-DA染色結果表明，與正常對照組比較(熒光強度為9.165±2.797)，UVB組ROS的熒光增強(熒光強度為93.39±6.051)。證實UVB輻射增強了HaCaT細胞內ROS水平(t=30.948,P=0.000)。經不同濃度葡萄籽原花青素處理后， HaCaT細胞內ROS熒光強度明顯減弱(熒光強度為67.66±6.07、54.60±5.93、26.12±4.80)，提示葡萄籽原花青素處理能夠顯著抑制UVB輻射條件下ROS的生成(F=142.651,P=0.000)。

2.4 葡萄籽原花青素對UVB輻射條件下HaCaT細胞線粒體膜電位水平的影響 羅丹明123染色結果表明，與正常對照組比較(熒光強度為100.68±10.03)，UVB組 HaCaT細胞線粒體膜電位水平明顯降低(熒光強度為19.03±3.93)。證實UVB輻射降低了HaCaT細胞線粒體膜電位(t=18.561,P=0.000)。經不同濃度葡萄籽原花青素處理后， HaCaT細胞線粒體膜電位熒光強度明顯增強(熒光強度為35.49±5.61、61.52±7.68、78.92±6.60)，與UVB組比較,組間差異均有統計學意義(F=114.088,P=0.000)。

2.5 葡萄籽原花青素對UVB輻射條件下HaCaT細胞LDH，SOD，GSH-Px和MDA水平的影響 與正常對照組比較，UVB組中 HaCaT細胞中MDA水平，上清中LDH水平顯著增高(t=14.528,P=0.000;t=20.535,P=0.000)，同時SOD，GSH-Px水平顯著減少(t=18.829,P=0.000;t=11.394,P=0.000)。與UVB組比較，低，中，高劑量葡萄籽原花青素能夠明顯降低UVB輻射條件下HaCaT細胞中的MDA水平和上清中LDH水平(F=58.954,P=0.000;F=103.929,P=0.000)，且能夠提高細胞中的SOD，GSH-Px含量(F=81.320,P=0.000;F=18.113,P=0.000)。

2.6 葡萄籽原花青素對UVB輻射條件下HaCaT細胞Bcl-2，Bax和Cleaved-caspase3蛋白表達的影響 比較正常對照組，UVB組HaCaT細胞的Bax和Cleaved-caspase3蛋白水平顯著增高(t=51.071,P=0.000;t=39.166,P=0.000)；比較UVB組，低，中，高劑量葡萄籽原花青素處理后，HaCaT細胞的Bax和Cleaved-caspase3蛋白水平明顯降低，差異有統計學意義(F=246.836,P=0.000;F=368.861,P=0.000)。比較正常對照組，UVB組HaCaT細胞Bcl-2蛋白表達顯著下降(t=26.585,P=0.000)；與UVB組比較，低，中，高劑量葡萄籽原花青素處理后，HaCaT細胞Bcl-2蛋白表達顯著增高，差異有統計學意義(F=206.557,P=0.000)。

3 討論

葡萄籽原花青素是由黃烷-3-醇或黃烷-3, 4二醇聚合而成的一類多酚化合物，具有特殊抗氧化活性[8]，在運動保健領域已得到廣泛應用，它可以顯著改善運動員免疫功能，提高運動成績[9]，目前的研究表明原花青素對皮膚具有物理隔離紫外線的作用[10]，還具有美白等美容效果[11]，但具體機制研究并不深入。紫外線輻射對皮膚的損傷中，氧化損傷發揮重要作用，本文就原花青素對紫外線輻射所致的HaCaT細胞氧化損傷的保護作用進行了研究。

通過對葡萄籽原花青素不同濃度組對HaCaT細胞增殖活力的檢測，結果表明，50 μg/mL GSPE組、 100 μg/mL GSPE組、 200 μg/mL GSPE組對HaCaT細胞增殖活力無明顯影響。因此，葡萄籽原花青素的工作濃度采用50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL。30 mJ/cm2UVB照射后，HaCaT細胞凋亡率明顯上升，說明UVB輻射能誘導角質形成細胞凋亡。結果與Salucci的報道一致[12]。進一步細胞內ROS和線粒體膜電位的檢測表明，UVB輻射導致HaCaT細胞內ROS明顯升高，和線粒體膜電位的下降。以前的研究表明過量的ROS可以損傷細胞線粒體，引起線粒體氧化還原狀態失衡，導致線粒體膜電位水平下降，激活線粒體凋亡通路，誘導細胞凋亡[13]。Bcl-2和Bax是調節凋亡的上游信號，通過調控線粒體的通透性來調節細胞色素C的釋放，Bcl-2抑制細胞色素C的釋放，而Bax促進細胞色素C的釋放。線粒體細胞色素C釋放后能激活Caspase 9，進而激活Caspase 3，促進細胞凋亡[14]。為此，我們進一步檢測了HaCaT細胞內Bcl-2，Bax，Cleaved caspase3的變化情況，結果證實，HaCaT細胞在受到UVB輻射后，Bax，Cleaved caspase3的水平明顯上升，而Bcl-2水平則顯著下降。在經過50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL葡萄籽原花青素處理后，比較UVB組，HaCaT細胞凋亡顯著減少，細胞內ROS水平顯著下降，而線粒體膜電位明顯上升。同時，Bcl-2蛋白表達顯著上升，Bax，活化Caspase3的水平明顯下降。說明葡萄籽原花青素可以通過抑制UVB輻射導致的細胞內ROS過量產生，保護線粒體膜電位水平，進而抑制UVB輻射誘導的細胞凋亡。

為了闡明葡萄籽原花青素對UVB輻射導致的細胞氧化損傷的具體作用機制，我們又檢測了細胞中SOD、GSH-Px、MDA，以及上清中LDH的水平，以往的研究表明MDA 是氧化應激的主要產物， 它們反映了細胞受自由基損傷的水平[15]，而SOD、GSH-Px具有顯著的抗氧化功能[16]。30 mJ/cm2UVB輻射后，UVB組與正常對照組相比，MDA含量增高，而抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性顯著下降。但HaCaT細胞經過不同濃度的葡萄籽原花青素處理后，細胞SOD和GSH-Px活性增高，MDA含量下降，說明葡萄籽原花青素能促進抗氧化酶活性，減少氧化應激產物的產生。紫外線輻射產生的過量ROS使細胞膜的脂質雙層結構氧化，通透性增加，細胞內LDH通過受損的細胞膜進入到上清中[17]，因此，上清中LDH的含量是細胞膜氧化損傷的重要標志，比較正常對照組，UVB組上清中LDH水平顯著升高，而經過不同濃度葡萄籽原花青素處理后，上清中LDH水平顯著下降，結果進一步證明，葡萄籽原花青素對UVB引起的細胞膜氧化損傷也具有明顯保護作用。

綜上所述，本研究證實了葡萄籽原花青素能拮抗中波紫外線誘導的角質形成細胞凋亡，其機制可能與葡萄籽原花青素能促進抗氧化酶的活性，減少ROS的產生，維持線粒體膜電位，抑制線粒體凋亡途徑的活化有關。本研究為葡萄籽原花青素在皮膚科學中的進一步開發和應用提供了一定的依據。