脂聯素對急性呼吸窘迫綜合征大鼠炎性因子及細胞凋亡因子的影響

王春亞，馬琪，張娜，裴斐

作者單位：西安交通大學第二附屬醫院，a心血管外科，b重癥醫學科，c病理科，陜西 西安710004

急性呼吸窘迫綜合征（Acute respiratory distress syndrome，ARDS）是臨床常見急危重癥之一，多繼發于嚴重感染、休克、創傷等疾病過程中，其主要發病機制為各種病因繼發炎癥反應導致肺毛細血管內皮和肺泡上皮細胞損傷造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，引起急性呼吸功能障礙［1］。近年來，隨著分子生物學的不斷進展，細胞凋亡在ARDS的發病過程中所起的作用日益受到重視，故干預細胞凋亡可能是治療ARDS的新手段和方式，值得更進一步深入探討。脂聯素（Adiponectin，APN）是一種由脂肪細胞分泌的蛋白質激素，具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、增加胰島素敏感性等多種生物效應。以往的研究發現APN可通過多種機制發揮抗炎作用，達到肺保護作用。但APN是否通過改變ARDS的細胞凋亡來影響病情發展，國內外鮮有報道。本課題于2018年1—12月擬針對這一方面展開深入研究。

1 材料與方法

1.1材料雄性Wistar大鼠45只，體質量范圍為150～200 g，周齡范圍為6～7周，購于第四軍醫大學實驗動物中心，動物許可證號SCXK（陜）2014-002。鼠基因重組APN購于Biovision公司（CA.USA）；細菌內毒素（Lipopolysaccharide，LPS）購于美國Sigema公司；檢測腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor a，TNF-α）和白細胞介素-10（Interleukin 10，IL-10）的Elisa試劑盒及檢測凋亡因子的蛋白質印跡法（Western Blot）試劑盒均購于杭州聯科生物技術股份有限公司。

1.2方法選用同種同窩Wistar雄性大鼠45只，采用隨機數字表法分為三組，分別為對照組、LPS組和APN組。制備模型前禁食不禁水12 h，LPS組：經腹腔注射LPS 7.5 mg/kg，APN組：造模前12 h經腹腔注射鼠重組 APN 6 mg/kg［2］，對照組：經腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.3標本采集與指標測定

1.3.1 血標本采集 造模12 h后，用10%水合氯醛0.35 mL/100 g對大鼠進行腹腔麻醉，用器械分離組織，暴露心臟，用5 mL注射器穿刺采血5 mL，緩慢注入含有10%乙二胺四乙酸（EDTA）的干燥試管中，立即搖勻，2 000 r/min，離心20 min，取上清液置于-80℃超低溫冰箱凍存待測。

1.3.2 肺組織的采集 游離出左下肺，取部分肺組織，經甲醛固定后，脫水、石蠟包埋切片，采用蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察各組肺組織病理學變化；剩余左肺下葉組織標本用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次，按照1 mL/100 mg的比例將肺組織加入PBS中，使用電動勻漿機制成勻漿，以4℃，12 000 r/min離心后取上清，置于-80℃凍存備用。

1.3.3 血漿和肺組織中 TNF-α、IL-10的測定 采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測各組大鼠造模后12 h血漿中TNF-α、IL-10，其方法嚴格按照試劑盒說明書步驟操作。

1.3.4 肺組織中B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）蛋白相對含量測定 采用蛋白質印跡法測定。提取肺組織中總蛋白質，以牛血清白蛋白作為標準曲線，BCA法測定蛋白濃度，常規電泳轉膜，封閉后分別加入Bax、Bcl-2、Caspase-3抗體或β-肌動蛋白（β-actin）抗體4℃輕搖過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶抗體標記二抗，化學發光試劑增強反應X線壓片曝光，將膠片進行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統分析目標帶的光密度值。以Bax、Bcl-2、Caspase-3或 β-actin條帶的吸光面積積分比值來評定蛋白表達水平。

1.4統計學方法采用SPSS 23.0統計軟件包進行統計分析，連續變量（非正態分布資料）采用中位數（下、上四分位數）［M（P25，P75）］進行描述，多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，對差異有統計學意義（P＜0.05）的指標進一步進行多組間兩兩比較，以P＜0.016 7為差異有統計學意義。

2 結果

2.1三組大鼠血漿中TNF-α、IL-10水平比較APN組和LPS組的TNF-α及IL-10水平均高于對照組，而低于LPS組（P＜0.016 7）。見表1。

2.2三組大鼠肺組織中TNF-α、IL-10水平比較APN組和LPS組的TNF-α及IL-10水平均高于對照組，而低于LPS組（P＜0.016 7）。見表2。

2.3各組大鼠肺組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達水平比較LPS組和APN組的三種蛋白水平均高于對照組（P＜0.016 7）；APN組的Bcl-2高于LPS組，Caspase-3低于LPS組（P＜0.016 7），而Bax水平兩組間差異無統計學意義（P＞0.016 7）。見表3。

表3 三組大鼠肺組織中B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）蛋白水平比較/M（P25，P75）

2.4三組大鼠肺組織病理改變光鏡下，對照組大鼠肺組織結構正常，肺泡形態完整，肺間質結構清晰；LPS組肺泡組織結構不清，間隔明顯增厚，間質充血水腫明顯，肺泡腔內有大量中性粒細胞浸潤，可見不同程度的塌陷及肺不張；APN干預組肺間質充血、水腫程度較模型組減輕，肺泡腔內炎癥細胞浸潤減少。見圖1。

3 討論

近年來，盡管ARDS的基礎研究及臨床診治取得長足發展，但其病死率仍可高達35%～40%，值得密切關注［3］。目前關于ARDS的發病機制有多種學說，其中最主要的為炎癥反應學說，當各種病因誘發失控性炎癥反應時，會引起血管內皮細胞及肺泡上皮細胞的通透性增加，繼而各種炎癥細胞及富含蛋白的水腫液，進入肺泡腔及肺間質，最終導致呼吸衰竭［4-5］。參與ARDS發病的炎性介質中，影響最大的是TNF-α和白細胞介素。TNF-α是炎癥反應級聯中至關重要的始動因子，主要由巨噬細胞分泌，可增強中性粒細胞的吞噬能力，并且上調ICAM-1的表達，激發中性粒細胞釋放更多炎性因子［6］。白介素包括促炎因子和抗炎因子，IL-10作為人體內重要的抗炎因子，可抑制炎癥反應，重建炎癥反應和抗炎反應的平衡。研究發現因ARDS死亡病人的疾病初期，其肺泡灌洗液中的IL-10水平較低，推測IL-10不足可能是導致促炎因子生成增多以及肺內炎癥反應加劇的原因之一［7］。本研究采用LPS腹腔注射造模的肺組織病理切片提示與對照組相比，模型組肺組織的炎癥反應明顯加重。進一步將對照組和LPS組大鼠相關炎性指標進行對比，結果發現無論是肺組織還是血漿中TNF-α和IL-10水平，LPS組均高于對照組，說明促炎因子水平增加時，機體內的抗炎因子水平也會相應增加，來維持機體促炎反應與抗炎反應的平衡。

APN是一種具有抗炎效應的細胞因子，可通過多種機制下調IL-6、TNF-α等促炎因子水平，上調抗炎因子水平［8-9］，并能直接與細菌脂多糖相結合來改善炎癥反應，減輕靶器官損害程度。APN與ARDS發病有一定相關關系，Jason M Konter等［10］發現經氣道滴入脂多糖，APN-/-組小鼠的肺損傷程度及炎癥反應均重于對照組，而動物實驗證明外源性補充APN可減輕ARDS及炎癥反應性疾病的嚴重程度，并改善預后［11］。本實驗APN組在ARDS造模前12h經腹腔注射APN，其病理結果發現，經APN干預的大鼠肺組織損傷程度相較于LPS組明顯減輕，且肺組織和血漿中TNF-α和IL-10水平均明顯低于LPS組，說明減輕炎癥反應是APN控制肺組織損傷的機制之一，這與之前的研究結果相似。

除了炎癥反應機制，近年來細胞異常凋亡在ARDS的發病過程中所起的作用日益受到重視。目前認為有三類細胞的凋亡與ARDS發病密切相關，包括多形核粒細胞（Polymorpho-nuclear leukocyte，PMN）、肺泡上皮細胞及肺血管內皮細胞，其中最主要的是PMN細胞。該細胞是機體防御外來病原體的第一道防線，具有非特異性防御功能，在機體發生ADRS時，PMN被過度激活，并釋放大量炎性介質、活性氧自由基、蛋白水解酶等，導致組織及器官的損傷，因此其適時凋亡對減輕組織損傷具有重要意義。但研究發現，ARDS早期，PMN凋亡延遲，同時伴有內皮細胞和肺泡上皮細胞凋亡增強，凋亡通路的失衡可能在ARDS發病過程中發揮重要作用［12］。目前研究較多的與ARDS相關的凋亡因子，包括抑凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax及Caspase-3［13］。Bcl-2是一種主要分布于核膜、線粒體外膜和內質網膜的膜結合蛋白，可以通過多種途徑參與細胞凋亡過程，是多種細胞凋亡調節的關鍵性因子，其高表達往往可以阻止正常細胞的凋亡程序的啟動，從而延長細胞壽命［14］。在ARDS急性期，Bcl-2呈現低表達，導致病情加重［15］。Bax定位于細胞質，屬于Bcl-2家族成員之一，轉染Bax不僅能引起許多細胞自發凋亡，而且能夠促進多種因素引起的多種細胞凋亡。Bax與Bcl-2具有一定同源性，可形成一對具有雙向調節作用的異型二聚體，其比例決定了細胞生存還是凋亡［16-17］。Guinee等［13］的研究發現，在彌漫性肺泡損傷的病人中，其肺組織Bax蛋白的表達顯著性增高，提示Bax的高表達與急性肺損傷密切相關。Caspase-3是Caspase酶系家族中的重要一員，是凋亡通路的關鍵執行者，可通過多個途徑來參與ARDS的發生發展。有研究發現在急性胰腺炎肺損傷中，Capase-3蛋白酶表達早期即可出現升高，表明急性肺損傷與Caspase-3蛋白表達升高有著密切關聯［18-19］。多種凋亡因子的共同作用決定著ARDS的發生發展。故此干預細胞凋亡可能是治療ARDS的新手段和方式。本研究將三組大鼠肺組織中的抑凋亡因子Bcl-2，和促凋亡因子Caspase-3及Bax進行比較，結果發現APN組的Bcl-2表達高于LPS組，而Caspase-3表達均低于LPS組，說明APN通過對凋亡因子調控來達到肺保護作用。然而本實驗僅發現這一現象，但APN具體是通過哪些途徑來調控凋亡因子的水平并不清楚，未來擬通過進一步研究來闡明其中的機制。

綜上所述，APN不僅通過抑制炎癥反應降低ARDS大鼠的肺部損傷程度，還可能通過影響組織細胞凋亡來達到肺保護作用。

（本文圖1見插圖12-1）