飼料微生態產品中糞腸球菌含量檢測方法的建立

武鳳嬌，韓鐫竹，高 鐸，李欣南

（遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心，遼寧 沈陽 110016）

飼用微生態制劑是作為飼料添加劑直接添加使用的微生態制劑[1]，作為一種新型綠色飼料添加劑，在養殖行業發揮了重要作用[2-3]。歐盟等發達國家的微生態制劑產品銷量可觀，在抗生素替代產品的研發中已經走在了世界的前列[4]。其作用機理主要有促進腸道優勢菌群形成、提高免疫力、保持腸道微生態平衡、提高生產性能、改善畜產品的品質和改善養殖環境等[5-6]。除此之外，微生態制劑無毒副作用、無藥物殘留、能夠產生天然抗生素、有效抑制微生物生長繁殖，有利于機體健康[7-11]。

近年來，我國飼用微生態制劑產業迅猛發展。在我國《飼料添加劑品種目錄》中已收載了34種允許使用的微生物菌種。這些菌種能夠將飼料中的纖維變軟，提高飼料的轉化率，明顯提高飼料品質[12-18]。但是由于新興產業市場不成熟，存在以下幾點問題：首先產品質量參差不齊，企業檢測能力各不相同；其次標準制定水平相對滯后，導致方法的適用范圍狹窄，應用性較差；再次微生態制劑產品的檢測標準仍處于空白狀態，導致市場監督缺位。為規范微生態制劑產品的生產與使用，填補微生態制劑產品檢測的標準技術空白。本試驗針對市場常見的飼用微生態制劑品種中的糞腸球菌進行了含量檢測方法的研究。本檢測方法對糞腸球菌的檢測方法研究與地方標準的制定具有重要意義。

1 試驗材料

1.1 菌株來源質控菌株為ATCC29212，購自北京蘭伯瑞生物技術有限責任公司；試驗菌株為不同企業的含有糞腸球菌的微生態制劑產品。

1.2 稀釋液、培養基及試劑0.85%滅菌生理鹽水、糞腸球菌培養基、哥倫比亞血瓊脂培養基、革蘭染色液、革蘭氏陽性菌鑒定卡或生化鑒定試劑。

1.3 設備和玻璃器皿 恒溫培養箱（精度36±1℃）、玻璃或塑料平皿（90 mm）、L形玻璃或塑料涂布棒、吸管或移液器（0.1 mL、1 mL、10 mL）、廣口瓶或三角瓶（500 mL）、離心管（50 mL）、高壓滅菌鍋、微生物鑒定系統、振蕩器、渦旋儀、麥氏比濁儀、顯微鏡。

2 試驗方法

2.1 確證試驗使用商業化的生化鑒定試劑盒或生化鑒定管，對糞腸瓊脂培養基上的培養物進行生化鑒定，按說明書操作進行。也可使用微生物鑒定系統進行生化確證試驗。

2.1.1 菌種制備 自平板上挑取單菌落，劃線轉接培養于哥倫比亞血瓊脂培養基上，36±1℃培養48±2 h，從每一平板中選取至少1個良好分離的特征菌落，轉接保存，進行生化確證試驗。

2.1.2 細菌DNA提取 采用細菌基因組DNA提取試劑盒進行細菌DNA提取，按照試劑盒步驟操作，通過微量紫外分光光度計進行DNA含量測定，所提取的的DNA濃度均＞100 ng/μL，A260/A280值均在1.8～2.0之間，滿足后續試驗的要求。細菌DNA提取液于-20℃保存備用。

2.1.3 形態觀察 挑選純化的單菌落做革蘭氏染色鏡檢。

2.1.4 生化確證試驗 挑取純化的單菌落，使用麥氏比濁儀，調至適宜的菌濃，用生化鑒定試劑盒、生化鑒定管或微生物鑒定系統，按說明進行鑒定試驗。

2.1.5 PCR確證試驗 通過文獻檢索，確定糞腸球菌PCR反應引物及反應體系[19]，應用在PCR確證試驗中。引物F5’-TGCCGCATGGCATAAGAG-3’；R5’-TGCATCACCTCGCGGTCTAG-3’。PCR反應體系如表1所示。

PCR反應程序設定如下：①預變性：95℃5 min；②變性：95℃45 s；③退火：48℃45 s；④延伸：72℃45 s；⑤保溫：4℃30 min。步驟②～④的循環數設為30。

表 1 PCR反應體系Table 1 PCR reaction system

2.2 計數培養基的篩選通過大量文獻檢索、資料查閱和基層調研，發現糞腸球菌計數培養基主要為糞腸球菌培養基、MRS培養基、腸球菌顯色培養基、哥倫比亞血瓊脂。使用含有糞腸球菌的單一和混合型飼料微生態制劑對培養基進行系統篩選篩選專屬性強、易于觀察計數的糞腸球菌計數培養基。

2.3 方法適用性試驗通過檢測5個微生態生產企業的15個產品（包括單一型和混合型飼料微生態產品），對試驗建立的方法進行方法的適用性考察。

2.3.1 檢樣的制備及稀釋 以無菌操作稱取試樣25 g（mL），加入225 mL 0.85%滅菌生理鹽水的三角瓶中（瓶內預置適當數量的玻璃珠）。置振蕩器上，振蕩30 min。經充分振搖后，制成1:10的均勻稀釋液。用滅菌吸管吸取1:10的均勻稀釋液1 mL，置于滅菌的9 mL 0.85%滅菌生理鹽水離心管中，密封，渦旋儀渦旋10 s，經充分混勻后制成1:100的稀釋液。根據樣品含菌量，按上述稀釋次序遞次稀釋至適宜的稀釋倍數。

表2 四種培養基成分表Table 2Composition of four media

2.3.2 接種和培養采用涂布法。選擇2個或者3個適宜的稀釋度，用滅菌吸管分別吸取0.1 mL，接種到糞腸球菌瓊脂平皿上，每個濃度接種2個平皿，使用無菌的涂布棒盡可能小心快速地涂布接種于培養基表面，涂布棒不得接觸平皿邊緣。每個平皿用1支無菌涂布棒。涂布好的平皿蓋好后室溫中放置15 min，使接種物完全被培養基吸收為止。翻轉上述平皿置36±1℃恒溫培養箱中培養48±1 h。

2.3.3 菌落計數及篩選 培養后，選取菌落數在30～300個之間的平板計數。若平板中有較大片狀菌落生長時不宜采用，若片狀菌落不到一半，而其余一半中菌落分布有很均勻，即可計算半個平板后乘以2以代表整個平皿的菌落數。

3 結果與分析

3.1 形態學結果 典型糞腸球菌菌落呈圓形，表面光滑、隆起，菌落呈黑色或淡黑色，直徑在0.5～2.0 mm。然后從中選出5個特征菌落進行確證試驗。

3.2 鏡檢結果糞腸球菌細胞應為球形，可順鏈的方向延長，直徑0.5～1.0 μm，單個、大多數成雙或短鏈狀排列，革蘭氏染色陽性，無芽孢，通常不運動。

3.3 生化確證結果 依據《伯杰細菌鑒定手冊》（第九版）、《常見細菌系統鑒定手冊》、《分子克隆實驗指南》第三版進行生化鑒定。糞腸球菌的主要生化特性見表3。

3.4 PCR鑒定確證結果通過對糞腸球菌標準菌株（ATCC29212）、金黃色葡萄球菌（ATCC29213）等標準菌株進行PCR擴增，擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示該組引物對糞腸球菌具有較好的特異性。PCR鑒定結果如圖1。對5份含有糞腸球菌的飼料微生態制劑進行了PCR擴增，擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示該組引物能夠很好的擴增出混合產品中的糞腸球菌，具有較好的專屬性。鑒定結果如圖2。

表 3 糞腸球菌的主要生化特性Table 3 Main biochemical characteristics of enterococcus faecalis

3.5 計數培養基的篩選標準糞腸球菌菌株在試驗所選的4種培養基上均生長良好，圖3為標準糞腸球菌菌株分別在哥倫比亞血瓊脂、腸球菌顯色培養基、糞腸球菌培養基及MRS培養基上的菌落特征。但由于哥倫比亞血瓊脂和腸球菌顯色培養基成本較高，在實際生產中并不適用。

圖 1 標準菌株的PCR鑒定圖譜Fig.1 PCR identification map of standard strains

圖 2 5份含有糞腸球菌的飼料微生態制劑PCR鑒定圖譜Fig.2 PCR identification of five feed microecological preparations containing enterococcus faecalis

圖 3 標準糞腸球菌菌株在不同培養基上的菌落特征Fig.3 Colony characteristics of enterococcus faecalis in different media

圖 4 混合型飼料添加劑中糞腸球菌在不同培養基上的菌落特征Fig.4 colony characteristics of enterococcus faecalis in different media in mixed feed additive

同時，對混合型飼料添加劑中糞腸球菌，也進行了培養試驗，圖4為含有枯草芽孢桿菌和糞腸球菌的飼料微生態制劑產品在哥倫比亞血瓊脂、腸球菌顯色培養基、糞腸球菌培養基及MRS培養基上的菌落特征。由圖4可見，混合型產品中的枯草芽孢桿菌和糞腸球菌在哥倫比亞血瓊脂和MRS培養基上生長良好，但枯草芽孢桿菌嚴重干擾了糞腸球菌的生長，不能實現糞腸球菌的計數。而腸球菌顯色培養基和糞腸球菌培養基抑制了枯草芽孢桿菌的生長，能夠實現糞腸球菌的計數。

3.6 方法適用性考察用本試驗建立的檢測方法分別檢測不同企業不同產品，結果如表4所示，表明該方法具有較好的適用性，能夠滿足實際生產的需要。

表 4 方法比較Table 4Comparison of methods

4 討論

通過對糞腸球菌計數培養基進行系統的研究發現，單一飼料添加劑在4種培養基上生長均良好。但MRS的pH值對糞腸球菌的生長影響較大，市售的MRS培養基pH值一般為6.2左右，實際操作中需要調節MRS的pH值為7.2左右。哥倫比亞血瓊脂配制較難，不易保存，有效期只有7 d，且成本較高。而混合型飼料添加劑中糞腸球菌在MRS培養基和哥倫比亞血瓊脂培養基上的分離效果不好，混合型飼料添加劑中的枯草芽孢桿菌對糞腸球菌的生長有抑制作用，導致糞腸球菌不生長或很少生長。盡管文獻報道通過MRS改良、調節pH和加入氯化鈣等可抑制枯草等生長，但培養條件苛刻，結果不穩定。腸球菌顯色培養基雖然分離效果好，計數方便，但是和哥倫比亞血瓊脂一樣，價格貴，成本高，不易于企業節約成本，實際生產中并不適用。

目前，企業微生態制劑產品標準起草中，未要求對所含益生菌進行生化或PCR鑒定，缺少輔助鑒定環節，導致微生態制劑產品中實際添加益生菌種類與產品標簽不符偶有發生。同時，市售混合型微生態制劑產品添加的益生菌種類較多，篩選出能夠具有較高專屬性的分離計數培養基，是企業自身保證產品質量的關鍵手段。因而，企業標準應增加準確的鑒定方法，選用專屬性較高的計數培養基，對于監督產品生產與產品質量，維護市場秩序具有重要意義。

5 結論

通過對飼料微生態制劑中糞腸球菌含量檢測方法的研究，建立了飼料微生態制劑中糞腸球菌含量檢測方法，確定了生化鑒定和PCR鑒定方法，并篩選出糞腸球菌培養基作為檢測飼料微生態產品中糞腸球菌含量的計數培養基。通過市售的飼料產品驗證，此方法適用于單一型和混合型飼料微生態制劑中糞腸球菌的含量檢測。