微載體培養BHK-21細胞生產狂犬病毒Flury株的研究

劉艷霞

（遼寧益康生物股份有限公司，遼寧 遼陽 111000）

狂犬?。≧abies）是由狂犬病毒感染引起的一種致死性、人獸共患的傳染病，表現為急性、進行性、幾乎不可逆轉的腦脊髓炎，臨床表現恐水、怕風、興奮、咽肌痙攣、流涎、進行性癱瘓等癥狀，最后因呼吸、循環衰竭而死亡[1]。犬狂犬病在80多個國家和地區廣泛分布，主要是發展中國家。99%以上的人狂犬病病例的病毒都來自于犬[2]。通過大幅度提高犬的免疫覆蓋率，在控制了犬狂犬病流行的同時也使人狂犬病的發病率顯著降低[3-4]?？袢∪醵净钜呙绲陌踩砸恢绷钊藫鷳n[5]，2017年7月1日，農業部發布第2514號公告，停止生產使用狂犬病活疫苗（包括多聯活疫苗）。目前國內市場上獸用狂犬病滅活疫苗毒株主要為FluryLEP株、Flury株、PV206株、CVS-11株、CNT-1株、SAD株、dG株、PV/BHK-21株，其中絕大多數采用傳統的轉瓶培養工藝進行生產。高滴度的抗原液是疫苗生產中非常重要的一個環節。本試驗利用臺灣TideCell-010型生物反應器，采用BioNOCTMⅡ型微載體培養BHK-21細胞繁殖狂犬病毒Flury株，提高抗原液的病毒滴度，降低成本，為制備高品質的獸用狂犬病滅活疫苗奠定基礎。

1 試驗材料

1.1 細胞 BHK-21細胞由美國典型菌種保藏中心（ATCC）引入，由遼寧益康生物股份有限公司對BHK-21細胞系進行建庫和檢驗，符合生產標準。

1.2 毒種 狂犬病病毒Flury株，由遼寧益康生物股份有限公司鑒定、保管和供應。

1.3 主要儀器和試劑Tide Cell-010型高密度細胞培養生物反應器（潮汐式曝氣式，載體床型）、葡萄糖濃度測試計、BioNOCTMⅡ型微載體、葡萄糖濃度測試芯片均購至賽宇細胞科技股份有限公司；細胞計數儀購至上海睿鈺生物IC1000；新生牛血清為內蒙古金源康生物工程有限公司；DMEM高糖細胞培養基為Gibco；細胞生長液為8%FCS DMEM；細胞維持液為2%FCS DMEM等。

2 試驗方法

2.1 Tide-Cell培養BHK-21細胞條件優化和工藝的確定 轉瓶培養BHK-21細胞形成致密單層，胰酶消化、回收細胞，得到種子細胞混懸液。通過對混懸液內的細胞計數，進行了三批次的種細胞不同初始接種數量試驗，起始細胞總數分別接入5×109個cells、10×109個cells及20×109個cells。將種子細胞接入含有500 g的BioNOCⅡ型微載體的10 L載體瓶內，在37℃條件下開始吸附，經過3 h的吸附，液位上下浮動為1 L的流動體積，液面的上滯留時間為2 min，液位下滯留時間為30 s，以使細胞與載體能夠充分接觸，增強吸附效果。吸附結束后，進入細胞培養程序，控制培養液溶氧達到30%以上，pH穩定在7.2～7.4。由于BHK-21細胞代謝較強，液位上下浮動為8 L的流動體積，流速為3 500 mL/min，液面的上滯留時間為1.5 min，液位下滯留時間為30 s，為細胞生長提供一個舒適的培養環境，采用連續批次換液方式培養BHK-21細胞，生長液的pH值穩定在7.2～7.4。細胞在生物反應器上培養120 h后，無菌條件下采集載體樣品，結晶紫細胞核計數方法，用細胞計數儀計數。每間隔24 h，取培養液樣品并測定殘余葡萄糖含量，通過載體內細胞對葡萄糖的消耗量評價細胞生長狀況及數量。

2.2 Tide-Cell培養Flury株病毒的接毒量優化 細胞培養使用連續批次換液方式，Tide-Cell培養BHK-21細胞120 h后，葡萄糖消耗量約為8 g/（L·h），此時細胞活性較好，為最佳接毒時機。參考平面培養Flruy株的最適接毒量和MOI，選用MOI分為0.2、1和2（三次試驗）的3個不同感染復數，含有以上病毒量的8 L細胞維持液接入已排空細胞生長液的載體罐內，靜止細胞吸附病毒1 h后，開始病毒培養，間隔24 h采樣，用直接免疫熒光法測定樣品TCID50毒價（按Reed-Muench法計算）。了解病毒增殖情況，通過病毒培養曲線確定最佳MOI。

2.3 Tide-cell培養Flury株病毒培養條件及收獲抗原液時間的優化 將4～5代狂犬病病毒Flury株按照合適比例（最佳MOI）接入載體瓶內，靜止吸附1 h。開始病毒培養后，補加維持液至50 L，間隔24 h采樣測定毒價和收獲抗原液50 L后，補加相同量的新病毒維持液，并且按照此方法連續收獲抗原液，直到抗原液毒價低于107.5TCID50/mL為止。通過掌握狂犬病病毒在生物反應器的增殖曲線，以確定最佳收獲病毒抗原時間。通過連續重復3個批次Tide-Cell狂犬病滅活疫苗抗原培養，進一步完善工藝。

3 結果與分析

3.1 Tide-Cell培養BHK-21細胞條件優化和工藝的確定 結果說明生物反應器Tide-Cell培養BHK-21細胞吸附程序和培養程序，連續批次換液方式均合適。接種的細胞數為10×109個和20×109個培養120 h細胞總數無明顯差異，而接種的細胞數為5×109個表現出細胞數量偏少。同時，培養液葡萄糖含量測定結果也表明，細胞對其消耗量與細胞數量具有一定正相關性。

BHK-21細胞充分利用了三維立體結構的BioNOCⅡ微載體，與二維平面細基質相比表現出了非常大的優勢，細胞生長狀況見圖1和圖2。

3.2 Tide-Cell培養Flury株病毒接毒量優化 在Tide-Cell生物反應器上每一批次總計進行了12 d的病毒培養，接毒量MOI為1或者2時，接毒后48 h，病毒毒價即達到107.5TCID50/mL以上，此時開始收獲合格的病毒抗原液。第二批MOI為1的病毒增殖出現毒價高峰是在接毒96 h后，毒價為109.0TCID50/mL，明顯高于第一批MOI為0.2和第三批次MOI為2的108.3TCID50/mL和108.5TCID50/mL。從病毒高峰持續時間分析，第二批次病毒總體評價毒價也高于其他兩個批次，因此試驗結果表明最佳感染復數MOI為1，見圖3。

表1 反應器微載體接入不同初始量的BHK-21細胞的培養結果Table 1The cell culture result of Bioreactor microcarrier culturing BHK-21 cells inoculated with different amount of cells

圖1 平面培養BHK-21細胞Fig.1BHK-21cell culture on plate

圖2 BioNOC II載體培養BHK-21細胞Fig.2BioNOC II Microcarrier culture

3.3 生物反應器Tide-Cell培養狂犬病病毒Flury株抗原液 通過連續重復相同培養條件的3個批次試驗，可以確定接毒量MOI為1時，病毒培養48 h后，病毒抗原液毒價高于107.5TCID50/mL，開始收獲合格的病毒抗原液，一般每批次至少收獲10次毒價高于107.5TCID50/mL抗原液（每次50 L）。在收獲的抗原液里，病毒毒價最高達到109.3TCID50/mL高于傳統轉瓶工藝培養的15倍以上，且連續收獲毒價高于108.0TCID50/mL的收次高于5次，極大地提高了傳統工藝培養病毒毒價及總體產能，見圖4。

圖4 三批次狂犬病Flury株病毒培養曲線Fig.4 Three batch of Rabies virus proliferation curves

本工藝研究試驗，至少含有1×1010個細胞的生長液接入Tide-Cell培養系統載體瓶內，設定參數，進入細胞吸附載體培養。細胞培養使用連續的批次換液方式，總體pH值控制在7.2～7.4，DO在30%以上。在培養期間，一般間隔24 h采樣，測定葡萄糖殘留量，同時也通過計算糖的消耗量來評估監測細胞生長狀況。當細胞培養約為120 h，葡萄糖消耗量達到8 g/（L·h）附近時，細胞數達到4×1011個，按照MOI為1接入Flury株種毒，靜止吸附1h后開始病毒培養。病毒培養過程pH控制在7.4～7.5，DO在30%以上。使用細胞維持液量滿足細胞培養病毒需要，并能對維持液內完整的病毒顆粒保護。一般至少可以收獲10次毒價高于107.5TCID50/mL的抗原液，包含5收次毒價為108.0TCID50/mL的抗原液。

4 討論

通過這三批次試驗，為生物反應器培養狂犬病抗原培養工藝累積了寶貴的試驗數據，能夠為實現將來的大規模工業化生產奠定基礎。Tide-Cell培養系統500 g BioNOCⅡ型微載體培養BHK-21細胞倍增速度和時間與王進產等[6]、譙小燕等[7]微載體培養BHK-21細胞密度略具優勢。Tide-Cell生物反應器培養BHK-21細胞生產的高毒價狂犬病病毒抗原，使狂犬病病毒的毒價由在轉瓶細胞上培養時的107.5TCID50/mL上升至最高的109.0TCID50/mL，提高了31倍。Tide-cell系統每一批次能收抗原液50 L，最少收獲10次，總計相當于500～800個以上轉瓶的產能，與傳統轉瓶工藝相比降低了成本。同時，降低了轉瓶培養過程批次間差異大，培養過程無法精確控制的缺點，有利于下游的濃縮和純化工藝，提高了狂犬病滅活疫苗的質量。動物細胞微載體懸浮培養技術市目前最具發展前途的細胞大規模培養技術之一，在未來生物醫藥領域的應用前景不可估量[8]。