葡萄糖—6—磷酸脫氫酶對鎘脅迫下紫花苜蓿生長的調節作用

李彩弟 朱帥鵬 李萍 青海大學生態環境工程學院 青海西寧 8100166

前言

青藏高原地處亞歐大陸腹地，地勢高聳，被稱為世界“第三極”，其平均海拔在4000m以上，氣候寒冷，年均溫度在0℃左右，空氣稀薄。青藏高原作為亞歐乃至世界水源涵養地和氣候調節器，其科學研究和生態屏障價值不言而喻，并日益引起社會的重視。然而長期以來，過度放牧、草地退化現象的日益加劇以及片面追求工業發展嚴重破壞了青藏高原的生態環境，因此提高畜牧業發展水平成為了一項緊迫任務。

紫花苜蓿是一種深根性多年生優質豆科牧草，被譽為“牧草之王”，具有高蛋白質、耐酸堿、耐貧瘠等特點，對我國畜牧業的發展及遏制三化(沙化、退化、鹽漬化)等均具有重大作用。青大1號紫花苜蓿是由青海大學自主培育的新品系，通過多年的選育，已經改變了在高寒地區不能安全越冬、返青率低的局面。

由于工業社會的的快速發展，如采礦、冶煉等，使水體、大氣以及土壤中鎘含量正在以每年數倍的速度增加。研究發現，鎘會通過食物鏈進入人體，誘發各科疾病。Cd2+具有強植物毒性，引發諸如H2O2積累以及還原型谷胱甘肽發生瞬時損耗來抑制植物生長。研究發現，紫花苜蓿粗蛋白的含量很容易受土壤中Cd2+的含量影響。鎘會破壞植物中的葉綠體結構，降低葉綠素含量，引起植物體衰老。有研究表明，鎘脅迫能抑制鹽芥幼苗生物量的積累，減少葉綠素和胡蘿卜素的含量，降低葉片的光合放氧速率。并且研究發現，低濃度鎘能促進這些植物的生長，高濃度鎘處理會增大細胞膜的通透性，使細胞膜受損。

G6PDH作為磷酸戊糖途徑中最重要的一個酶，嚴格調控著植物體內反應的速率及氧化還原反應的平衡。因此，G6PDH在植物體內有著不可替代的重要作用。陳超發現，G6PDH還具有抗氧化作用，能延長紅豆杉細胞活力，提高紫杉醇產量。有國外的科學家發現，G6PDH是植物抗氧化過程中的一個抗性酶。植物G6PDH有2種形式，一種存在于細胞質中，被稱為胞質型G6PDH，對氧化脅迫以及磷酸化無明顯反應；另一種存在于細胞基質中，被稱為基質型G6PDH，卻在對氧化脅迫的響應中被檢測到活性增強，這可能與G6PDH要行使不同調控功能有關。此外，在紫花苜宿受重金屬銅脅迫，大豆受干旱脅迫時，也發現G6PDH的活性有不同程度的提高。現有的結果表明G6PDH參與了對環境脅迫的應答，探索G6PDH對環境脅迫的響應，將有利于我們進一步認識G6PDH的功能，豐富植物的防御反應機制。

本試驗擬采用不同濃度CdCl2處理青大1號紫花苜蓿新品系幼苗，并測定其MDA及H2O2的含量和G6PDH活性等，初探G6PDH對鎘脅迫下紫花苜蓿生長的影響。研究結果有助于進一步研究紫花苜蓿對鎘脅迫的生理響應機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料：青大1號紫花苜蓿。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗材料準備

選取籽粒飽滿、結構完整的大小均一的種子，先用自來水沖洗10min，再用10%NaClO4消毒20min，然后用去離子水反復沖洗，最后將種子放置于鋪有濾紙的培養皿中。待種子晾干后，接種至錐形瓶中。每一個錐形瓶處理種子20粒，同時設置3個平行樣，培養時間約為十天，其中萌發前約為三天，溫度為18—20度，無需光照。萌發后約為七天，溫度為24—26度，16小時光照與8小時黑暗交替進行。

1.2.2 葉綠素、丙二醛、過氧化氫含量的測定

(1)選取其中生理狀態相同的植株移植于放有濾紙橋的新培養液中，培養液中CdCl2的濃度梯度為0，100μmol/L，200μmol/L，300μmol/L。其中每個濃度梯度為兩瓶，每瓶為9棵植株。并繼續在室溫條件下培養至5cm左右。

(2)測量其株高，根長(包含側根數目)，鮮重(包含根重與莖重)，葉綠素含量并記錄數據。完成后樣品保留備用。

(3)測量其MDA，H2O2含量，重復三次，并記錄數據。

1.2.3 G6PDH含量的測定

(1)選取其中生理狀態相同的植株移植于放有濾紙橋的新培養液中，培養液的體積均為50mL。并設置三個實驗組與一個對照組，第一個實驗組加入100μmol/L的CdCl2，第二個實驗組加入2.5mM/L的Na3PO4，第三個實驗組加入100μmol/L的CdCl2與2.5mM/L的Na3PO4。每瓶為9棵植株，并繼續在室溫條件下培養至5cm左右。

(2)測量其G6PDH含量，重復三次，并記錄數據。

1.3 測定方法

1.3.1 紫花苜蓿葉片葉綠素的提取

(1)根據古川昭雄(1981)提出的無水乙醇法。取幼葉100～200mg，置于10mL離心管并加入5mL無水乙醇。

(2)置于黑暗處24h，取上清液4mL，測定其在665nm和649nm處的波長。

(3)并計算

式中OD665、OD649分別為相應波長下的光密度值，V為提取液的體積，W為葉片鮮重，結果即為葉綠素含量。

1.3.2 丙二醛含量的測定

(1)參照Hodges等(1999)方法，略有改動。取1g葉片加入3mL0.1%TCA并研磨勻漿，于3300rpm情況下離心20min，取上清液，完成后樣品保留備用。

(2)取 上 清 液 500μL， 加 入 500μL0.1MTris—HCl，1mLTCA—TBA—HCl，置于離心管于95oC水浴30min,用冷水迅速冷卻，于3300rpm情況下離心5min，測定OD600，OD532，OD440nm處的光吸收值，并計算MDA濃度(μmol/L)=6.45×(OD532—OD600)—0.56×OD440，結果即為丙二醛含量。

1.3.3 H2O2含量的測定

(1)根據patterson等(1984)采用的TCA提取法[19]。取1g葉片加入3mL0.1%TCA并研磨勻漿，于3300rpm min—1下離心20min，取上清液，完成后樣品保留備用。

(2)取 上 清 液 500μL， 加 入 500μL0.1MTris—HCl，1mLKI，置于黑暗90min，測定OD390。

(3)并計算H2O2濃度(μmol/L)=OD390/M，結果即為H2O2含量。

1.3.4 蛋白質標準曲線的繪制

(1)根據考馬斯亮藍法。取6只試管，從1—6分別編號，按照表1加入標準蛋白液和蒸餾水，混合均勻。并向試管中加入5mL考馬斯亮藍G—250溶液，搖勻，放置2min后，在595nm波長下測定吸光度。

(2)根據測定的吸光度值繪制標準曲線(橫坐標為蛋白質含量，縱坐標為吸光度)，并求出標準線性方程。

(3)取粗酶提取液1.0mL，放入試管中，并加入5mL考馬斯亮藍G—250溶液，搖勻，放置2min后，在595nm波長下測定吸光度值。根據吸光度值通過標準曲線查得蛋白質含量。

表1 考馬斯亮藍G—250標準蛋白溶液配制表Tab.1 Coomassie brilliant blue standard solution configuration

1.3.5 鎘脅迫下紫花苜蓿葉片G6PDH活性的測定

(1)根據Setsuko Wakao(2005)采取的提取法，略有改動。取.0.5克葉片材料，用冰床研磨后，加入3mL配方[50mMHepes—Tris(pH7.8)，3mMMgCl2，1mMEDTA]研磨提取，勻漿液于4oC，12,000g離心20min，取上清即為粗酶提取液，并放置于冰床中。

(2)取 3mL配方加入 50μL15mMNADPNa2，50μL15mM6—PDHNa2，100μL粗酶提取液。空白對照用蒸餾水代替，啟動反應，測量在340nm處10min的間隔為30s的吸光值。

(3)選取10min內吸光值變化比較均勻的數值作散點圖，添加趨勢線，得到其回歸方程。

(4)并計算G6PDH酶活=a/(M×t)，其中a為線性方程斜率，M為蛋白質含量，t為反應時間10min。

1.4 數據處理

所得試驗數據用Origin8.0，SPSS17.0數據處理軟件進行。

2 結果與分析

2.1 鮮重、株高、根長在鎘脅迫下的變化

表2 不同濃度CdCl2對幼苗的影響Tab.2 Effects of different concentrations of CdCl2 on Seedlings

注：各小寫字母表示在0.05水平上有顯著性差異

由表2可知：在CdCl2的脅迫濃度為100μmol L—1、200μmol L—1、300μmol L—1時，青大1號紫花苜蓿的鮮重、株高、根長隨著CdCl2脅迫濃度的增加，呈現下降的趨勢，其中鮮重分別下降了9.4%、26.5%、33.4%，株高分別下降7.7%、30.7%、40.3%，根長分別下降 9.3%、33.3%、40.7%，并且與對照組相比差異顯著，說明一定濃度的CdCl2能使植株個體變矮，生長變緩，即對幼苗的生長產生了明顯的抑制作用。并且在200μmol L—1以后大1號紫花苜蓿的鮮重、株高、根長的降低趨勢明顯變緩，說明紫花苜蓿對鎘脅迫有一定的抵抗能力。

2.2 葉綠素含量在鎘脅迫下的變化

由圖1可知：在CdCl2的脅迫濃度為100μmol L—1、200μmol L—1、300μmol L—1時，紫花苜蓿幼苗中葉綠素含量隨著鎘濃度的的增加，出現下降的趨勢。其中葉綠素a分別下降17.8%、25.7%、34.5%，葉綠素b分別下降15.4%、17.6%、33.0%， 總 葉 綠 素 含 量 分 別 下 降 14.0%、26.7%、50.6%這與在觀察過程中出現的隨著鎘濃度的增加，植株變矮，葉片數量減少，葉片枯黃等癥狀相吻合。并且與對照組相比均差異顯著。說明CdCl2對葉綠素的含量有明顯的抑制作用。并且葉綠素b的含量的下降趨勢相比于總葉綠素的含量的下降趨勢要明顯平緩。由此得出，CdCl2通過破壞葉綠素的結構，減少葉綠素的含量來抑制紫花苜蓿幼苗的光合作用。

圖1 不同處理下紫花苜蓿幼苗葉綠素含量變化圖Fig.1 Changes of chlorophyll content in Alfalfa seedlings under different stress

2.3 MDA含量在鎘脅迫下的變化

圖2 不同處理下紫花苜蓿幼苗MDA含量變化圖Fig.2 Changes of MDA content in Alfalfa Seedlings unr ffrt t

據圖2所示：隨著CdCl2濃度的增加，紫花苜蓿幼苗中MDA含量升高，而且CdCl2脅迫濃度為 100μmol/L 時MDA含量為0.1958μmol/g，高于CdCl2脅迫濃度為0、200、300μmol/L時的 MDA含量為 0.1075、0.1582、0.1324μmol/g，與對照組相比均差異顯著。因此可以得出，CdCl2脅迫濃度為100μmol/L時，對植物的傷害程度更大。當植物受到鎘脅迫時，會產生大量的活性氧自由基引發膜脂過氧化，它的積累對于細胞膜及細胞結構會造成一定的傷害，所以丙二醛的含量可以反映植物在遭受脅迫時的傷害程度。

2.4 H2O2含量在鎘脅迫下的變化

據圖3所示：紫花苜蓿幼苗過氧化氫的含量隨著CdCl2濃度呈現先升高后下降的趨勢。其含量分別為0.051、0.077、0.065、0.064μmol/g。說明在逆境條件下，植物體內活性氧產生和清除系統受到破壞，所積累的活性氧能引發膜脂過氧化作用。過氧化氫是膜脂過氧化的產物，其含量反映植物遭受CdCl2傷害的程度。即在100μmol/L時紫花苜蓿幼苗體內遭受的破壞最嚴重，隨著Cd2+質量濃度繼續增加，幼苗體內會產生了某種防御機制從而減緩了遭受的破壞。

圖3 不同處理下紫花苜蓿幼苗H2O2含量變化圖Fig.3 Changes of H2O2 content in Alfalfa Seedlings under different stress

>2.5 G6PDH活性在鎘脅迫和抑制劑交叉作用下下的變化

據圖5所示：各柱形圖的酶活性分別為0.0136U mg—1min—1，0.0183Umg—1min—1，0.0142Umg—1min—1 ，0.0112Umg—1min—1。即紫花苜蓿幼苗在CdCl2處理后G6PDH活性升高，說明紫花苜蓿幼苗體內對CdCl2造成的損傷產生了響應而導致G6PDH活性升高，而用抑制劑Na3PO4處理后G6PDH活性降低了22.4%，且差異顯著，說明Na3PO4對G6PDH活性產生了抑制作用而導致活性降低，說明植物體內具有一定的防御機制，并且這種防御機制能在一定程度上減輕外部脅迫造成的損害。

圖4 蛋白質定量標準曲線Fig.4 Protein standard curve

圖5 不同處理下紫花苜蓿幼苗G6PDH活性變化圖Fig.5 changes of G6PDH activity in Alfalfa Seedlings under different stress

3 討論

3.1 鎘脅迫下葉綠素的變化

葉綠素是光合作用中最重要的一類色素，包括葉綠素a、b、c、d、f以及原葉綠素和細菌葉綠素，對光能的傳遞、吸收、轉換有重要作用。葉綠素很不穩定，在光、酸、堿、氧化劑等作用下會分解。在鎘脅迫下，葉綠素膜受到破壞，葉綠素含量下降。在Cd2+在50—300μmol/L范圍內，葉綠素含量急劇下降，導致葉片光合作用下降，生長變緩，植株變矮，葉片枯黃，這可能是Cd2+抑制紫花苜蓿幼苗生長的原因之一。

3.2 鎘脅迫下MDA、H2O2的變化

植物在Cd2+脅迫下膜脂過氧化作用進程加快，植物體內的活性氧含量提高，活性氧的代謝平衡被打破，從而啟動膜脂脫脂作用，破壞膜的結構和功能。重金屬是脂質過氧化的誘變劑，會導致脂質過氧化產物MDA、H2O2含量增加。本實驗表明，在Cd2+在0—100μmol/L范圍內的條件下，MDA、H2O2含量急劇上升，而在100—300μmol/L范圍內MDA、H2O2含量緩慢下降，表明在100μmol/L濃度時紫花苜蓿幼苗細胞內的功能結構收到的破壞最為嚴重，即體內收到的損害達到一定程度后才能啟動防御機制。

3.3 鎘脅迫下G6PDH的變化

在鎘脅迫下，細胞膜的結構受到破壞，從而引起細胞膜通透性增加，而膜通透性變化越大，表示細胞受傷的程度越嚴重。紫花苜蓿幼苗正是通過提高G6PDH活性來抵抗Cd2+的脅迫。本實驗中CdCl2處理后的植株G6PDH活性最高，雙重處理后的植株G6PDH活性次之，而抑制劑Na3PO4處理后的G6PDH活性最低，表明一定濃度的Cd2+對G6PDH活性有促進作用，而抑制劑Na3PO4對G6PDH活性有明顯的抑制作用。

4 結論

通過紫花苜蓿幼苗在抑制劑和鎘脅迫下其MDA、H2O2、G6PDH活性的變化研究，結果表明：MDA、H2O2含量隨著鎘脅迫的濃度的增加出現升先降后升的變化規律，而且抑制劑Na3PO4對G6PDH活性具有明顯的抑制作用。這表明紫花苜蓿幼苗具有一定的抗重金屬脅迫性，能夠在一定濃度的Cd2+條件下正常生長，并且紫花苜蓿幼苗具有一定的抗脅迫機制。并且說明G6PDH抑制劑會加劇苜蓿植株受到重金屬脅迫后所造成的氧化傷害的程度，表明了苜蓿幼苗通過增加G6PDH的活性來抵抗重金屬脅迫環境，避免植株受到嚴重的氧化傷害。因此G6PDH抑制劑會加劇植株遭受到重金屬脅迫的氧化傷害程度，從而證實了G6PDH參與抗脅迫性的調節。