高效液相色譜測定鯽魚組織中3-甲基喹噁啉- 2 -羧酸和喹噁啉- 2 -羧酸的殘留

應寒松，鐘世歡，裘鈞陶，葉佳明

（浙江公正檢驗中心有限公司，贊宇科技集團股份有限公司，浙江杭州 310009）

0 引言

卡巴氧和喹乙醇同屬于喹噁啉類化合物，是促生長作用的飼料添加劑，能夠提高飼料轉化率和利用率，對魚類致病菌具有抑制作用，被廣泛應用于水產品的促生長和疾病防治。毒理學研究表明，卡巴氧和喹乙醇具有致癌致畸的毒副作用[1]，因此世界上大多數國家禁止在水產品養殖和治療中使用卡巴氧和喹乙醇，我國也明文規定禁止將喹乙醇和卡巴氧用于水產養殖。喹乙醇和卡巴氧能在動物組織內迅速代謝產生的相應代謝物3 -甲基喹噁啉- 2 -羧酸（MQCA） 和喹噁啉- 2 -羧酸（QCA），是二者監控常用的目標殘留物。

目前水產品中MQCA和QCA常用的檢測方法有液相色譜法[2]、液相色譜-串聯質譜法[3]和氣相色譜-質譜法[4]。液質聯用的方法由于儀器昂貴、檢測成本高而不易推廣。液相色譜法[5]目前使用酶水解提取，前處理步驟較為復雜，回收率偏低。研究通過簡化前處理過程，通過酸水解前處理并使用固相萃取方法進行凈化，研究建立適用于鯽魚組織中MQCA和QCA測定的高效液相色譜法，為卡巴氧和喹乙醇代謝物檢測提供靈敏度高、重現性好的定量分析方法。

1 試驗設計

1.1.1 試驗材料

鯽魚，用組織研磨儀研磨，混合均勻。

氫氧化鈉（分析純）、鹽酸（分析純）、甲酸（色譜純）、甲醇（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）、3-甲基喹噁啉- 2 -羧酸（純度99.0%）、喹噁啉-2 -羧酸（純度99.8%）、試驗用水為超純水，Dr.Ehrenstorfer公司提供；OasisMAX固相萃取柱（60 mg/3 mL），Waters公司提供。

1.1.2 儀器和試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀配備紫外檢測器、AR2140型電子分析天平、IKA VORTEX GENIU 3型渦旋混合器、TGL-16G型臺式離心機、KS-300EI型超聲波清洗器、氮吹儀等。

1.2.1 提取

稱取5 g（精確至0.01 g） 樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL 1 mol/L的鹽酸溶液，渦旋混勻后超聲提取10 min，以轉速4 000 r/min離心10 min，取上清液，重復操作1次，合并提取液，加入10 mL正己烷，渦旋混勻，以轉速4 000 r/min離心5 min，取下層水相，待用。

1.2.2 凈化

將MAX固相萃取柱依次用2 mL甲醇、3 mL水活化，待試劑流至填料上層以下，加入樣品提取液，控制流速在3 mL/min以下。先后用3 mL 0.05 mol/L氫氧化鈉溶液和3 mL甲醇淋洗，抽干，用3 mL 2%含甲酸的乙酸乙酯溶液洗脫，洗脫液在40 ℃下氮吹吹干，用1 mL流動相復溶，渦旋混勻，以轉速14 000 r/min冷凍離心5 min，取上清液供液相色譜測定。

色譜柱：Agilent SB-C18柱（250 mm×4.6 nm，4.6 μm），流動相：1%甲酸水溶液和甲醇（甲酸水+甲醇=6+4）， 流速1 mL/min， 柱溫30 ℃， 進樣量20 μL，波長320 nm。

2 結果與分析

目前MQCA，QCA的檢測標準主要依據農業部781號公告-3-2006《動物源食品中3 -甲基喹噁啉- 2 -羧酸和喹噁啉- 2 -羧酸殘留量的測定高效液相色譜法》，該方法前處理步驟較多，采用該法再萃取和反萃取中，目標物容易損失，造成回收率偏低。試驗優化提取步驟，用鹽酸提取。試驗分別以HCl濃度和酸解時間對水解過程進行研究，用0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mol/L的HCl溶液進行水解；水解時間選擇10，20，30，40 min。試驗結果表明，1 mol/L HCl溶液水解10 min即可將目標物從組織中提取出來。

魚肉組織樣品經鹽酸提取正己烷去脂后，提取液含較多雜質，會對結果造成影響，采用固相萃取柱凈化后，能降低基質效應的影響，提高儀器靈敏度。根據MQCA，QCA的結構，分別選擇陰離子交換固相萃取柱（Oasis MAX柱）和反相固相萃取柱（Oasis HLB柱）進行凈化效果考查。試驗結果顯示，HLB柱凈化回收率為MQCA可達82.7%±2.5%，QCA可達79.3%±2.8%，MAX柱凈化回收率為MQCA可達93.5%±1.6%，QCA可達94.6%±2.1%，二者均能滿足MQCA，QCA的分析要求。二者比較，MAX柱回收率更高，因此選用MAX柱作為凈化萃取柱。

分別配置標準溶液，質量濃度分別為0.05，0.10， 0.20， 0.50， 1.00， 2.00 μg/mL 進行分析， 根據保留時間定性，使用峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標繪制標準曲線。

MQCA、QCA的質量濃度在0.05～2.00 μg/mL時呈線性分布，其中QCA線性回歸方程為Y=38.453 29X-0.117 32，相關系數為0.999 96；MQCA線性回歸方程為Y=26.435 17X+0.339 17，相關系數為0.999 97。采用空白基質添加MQCA，QCA標準品的方法，以3倍信噪比計算檢出限MQCA，QCA為4.0 μg/kg。

0.5 μg/mL的MQCA和QCA標準色譜圖見圖1。

圖1 0.5 μg/mL的MQCA和QCA標準色譜

選取鯽魚樣品，添加不同含量的MQCA，QCA標準品，按試驗方法進行處理，平行測定6份。

精密度與回收率見表1。

表1 精密度與回收率

由表1可知，QCA回收率為83.3%～88.5%，MQCA回收率為85.6%～90.2%，相對標準偏差小于5%。結果表明，此方法具有良好的準確性和可靠性。

3 結論

試驗使用酸水解提取鯽魚組織中MQCA，QCA，比較了不同濃度鹽酸提取效果，通過陰離子固相萃取柱凈化后，降低了基質效應，空白樣品加標回收和重復性良好。通過研究，建立了鯽魚組織中3 -甲基喹噁啉- 2 -羧酸和喹噁啉- 2 -羧酸的高效液相色譜法，可用于鯽魚樣品中喹乙醇代謝物和卡巴氧代謝物的定量分析和日常檢測。