鹽酸小檗堿和亞胺培南聯合作用對耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌體外抗菌活性的影響

吳靈玲 魏敦燦 陳浩浩

1.廣東省汕頭市濠江區河浦人民醫院藥械科，廣東汕頭 515098；2.汕頭大學醫學院第一附屬醫院藥劑科，廣東汕頭 515098

銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa）又可稱為綠膿桿菌，為廣泛分布自然界中的一類重要細菌之一，屬于較為常見的一種條件致病菌，同時也是導致院內感染發生的一類重要致病菌[1]。該病菌感染可會引起敗血癥、呼吸道感染、尿路感染、傷口感染等。臨床數據顯示，近年來，銅綠假單胞菌的分離及耐藥率均表現出明顯遞增趨勢，且對碳青霉稀類耐藥率有明顯升高，有廣泛耐藥菌株出現，這大大增加了疾病臨床治療難度，影響疾病治療效果及預后[2]。因此，加強對該類細菌耐藥情況進行深入研究具有重要臨床意義。本研究主要探討同時使用鹽酸小檗堿、亞胺培南兩種藥物對CPA體外抗菌活性產生的作用，現做如下報道。

1 資料與方法

1.1 一般材料

選取2016年2月～2017年5月本院臨床分離的80株CPA，實施法國梅里埃 VITEK2-CompactT檢測，同時實施Hodge實驗，根據檢測及實驗結果選取50株耐碳氫酶烯類銅綠假單胞菌。質控菌株27853由中國衛生部臨檢中心提供。研究所用抗菌藥物：亞胺培南，純度：98%，批號：160421，規格：5g/支；鹽酸小檗堿，純度：98%，批號：160528，規格；1g/支。兩種藥物均為上海源葉生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 制備菌懸液 實施菌種均實施復融、轉種以及分離培養，于相同平板取1～2個性狀相似的菌落，將其接種至LB液體培養基內進行10～12h的培養。使用RPMI1640液體培養基將LB培養液密度調節為2～6×108CFU/L 菌懸液。實施實驗時用RP-MI1640培養基將LB培養液稀釋至100倍，獲得接種菌懸液（密度為2～6×108CFU/L）。

1.2.2 配制藥物濃度 使用無菌蒸餾水分別將亞胺培南、鹽酸小檗堿干粉堿配成256μg/mL、2048μg/mL原液，再實施NCCLS 抗生素藥敏微量稀釋。亞胺培南最終濃度控制為 0.125～128μg/mL。

1.2.3 兩種藥物單獨藥敏試驗 使用NCCLS 微量倍比稀釋實施亞胺培南、鹽酸小檗堿稀釋后，在孵育箱（溫度：37℃）中放置18～24h后觀察結果。

1.2.4 鹽酸小檗堿交叉聯合抗真菌藥物藥敏試驗 選用棋盤微量稀釋法檢實施藥物同時應用作用。采用稀釋度為9個，最高濃度使其MIC的4倍，實施依次倍比稀釋，具體倍比濃度為1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256 倍。在 96 孔培養板上按照縱、橫兩列聯合兩種藥物稀釋。接種菌量選擇為1×105CFU/mL，將銅綠假單胞菌放置于孵育箱（溫度：37℃）中，放置時間為18～24h，然后仔細觀察細菌的生長情況。計算出部分抑菌濃度指數（FIC），并以該值為根據對聯合藥敏試驗效果進行評估。

1.2.5 單藥最低抑制濃度（MIC）值測定 MIC值通過微量肉湯倍比稀釋法檢測。制備單藥孔板：去96孔微型平板，在1～12各孔加入100μL肉湯，首列各孔加入100μL鹽酸小檗堿藥液（128μg/mL），實施倍比稀釋，使第1～11孔鹽酸小檗堿濃度稀釋至0.065～64μg/mL。在1～12各孔加入100μL已配置好菌懸液，使第1～11孔鹽酸小檗堿濃度稀釋為0.03～32μg/mL，將12孔作為陰性對照。按照如上方法實施亞胺培南單藥孔板制備，亞胺培南最終濃度控制為0.25～256μg/mL。放置于溫度為（35±2）℃溫箱中進行18～24h培養，然后觀察結果，并記錄MIC。

1.2.6 計算FIC及效果評估 MIC甲藥聯合/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯合/MIC=FIC。乙藥單用抗菌效果判定：（1）兩藥協同作用：FIC指數≤0.5；（2）兩藥相加作用：FIC指數≤1；（3）兩藥無關作用：1＜FIC指數≤2；（4）兩藥為拮抗作用：FIC指數＞2 。

1.3 統計學分析

試驗研究數據資料均通過SPSS 19.0軟件進行統計學分析。 MIC值等計量數據對比實施t檢驗處理，選用（±s）表示。以P＜0.05表示相互比較差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩藥單用作用

鹽酸小檗堿、亞胺培南單獨使用時，對CPA的MIC分別為258～519μg/mL、7～35μg/mL，均值分別為 261.00μg/mL、 8.75μg/mL，見表 1。

表1 兩藥單用時對CPA的MIC情況（± s ，μg/mL）

表1 兩藥單用時對CPA的MIC情況（± s ，μg/mL）

抗菌藥物 MIC范圍 MIC均值鹽酸小檗堿 258～519 261.00亞胺培南 7～35 8.75

2.2 兩藥聯合應用作用

同時使用兩種藥物時，鹽酸小檗堿、亞胺培南對CPA的MIC均有明顯減少，分別為2～33、2～ 17μg/mL，均值分別下降為 8.11、4.48μg/mL。同時使用兩種藥物時，表現為對5.02%的50株CPA呈無拮抗作用，88.42%的CPA呈相加抗菌作用，對6.56% CPA呈協同抗菌作用。兩種藥物聯用對 CPA表現出效果見表2。

2.3 兩藥單用、聯用時MIC比較

單用亞胺培南時，MIC值顯著大于與鹽酸小檗堿聯用（P＜0.05）；單用鹽酸小檗堿時，MIC值顯著大于與亞胺培南聯用（P＜0.05），見表3。

3 討論

銅綠假單胞菌屬于一種廣泛存在的革蘭陰性非發酵菌。目前，抗生素在臨床治療中得到廣泛應用，不合理用藥發生率也隨之不斷上升，銅綠假單胞菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥率也有明顯升高，甚至對部分抗生素完全耐藥[3-4]。因此，近年來，銅綠假單胞菌感染引發疾病的治療難度不斷增加。本研究選擇從中西醫結合角度，對亞胺培南、鹽酸小檗堿兩種藥物同時使用對CPA體外抗菌活性產生的影響進行深入研究，旨在探索耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌更加有效理想的治療方法。

表2 兩種藥物單用、聯用對50株CPA的FIC指數及MIC情況

表3 兩藥單用與聯用時MIC值比較（± s）

表3 兩藥單用與聯用時MIC值比較（± s）

亞胺培南（株數=50） 鹽酸小檗堿（株數=50）單用時MIC 8.88±0.64 266.45±5.75聯用時MIC 4.48±0.14 8.19±1.11 t 47.490 311.838 P 0.000 0.000

鹽酸小渠堿為從中藥黃連中提取的一種生物堿[5-6]。藥量作用研究已證實，鹽酸小檗堿、黃連均有良好消炎、抗菌等作用[7-8]。同時，既往研究也表明，鹽酸小檗堿的應用對CPA也表現出有效抗菌作用。本研究結果顯示，鹽酸小檗堿單獨使用時，其MIC值為261.00μg/mL。CPA耐藥機制主要如下：（1）產金屬酶，能夠水解β-內酰胺類及碳氫酶烯類抗生素，且不受碳氫酶烯類抑制；（2）細菌細胞膜上特定靶位、β-內胺類抗菌藥物二者相互結合后，會對細菌細胞壁肽聚糖分子產生有效抑制，促進細菌凋亡；（3）外排系統耐藥導致外膜蛋白形成一個主動外排系統，該系統導致藥物能夠直接泵出進入細菌體外；（4）細胞膜通透性不斷降低。該種細菌的細胞膜自身存在分子篩作用，能夠產生阻攔作用，使抗菌藥物無法進入細胞內[9]。OprD為現階段研究中發現的有一種能夠引起碳青霉烯類抗生素耐藥的膜孔蛋白，其表達下降或缺失均是使銅綠假單胞菌產生耐藥的一個重要機制之一[10-11]。

本次研究結果顯示，亞胺培南、鹽酸小檗堿兩種藥物聯合使用時，兩者的藥物濃度均影響減低，鹽酸小檗堿均值從261.00μg/mL降至8.75μg/mL，亞胺培南均值從8.75μg/mL降至4.48μg/mL。兩種藥物同時使用時，MIC值均顯著低于單獨用藥。景春娥等[12]研究表明，中藥鹽酸小檗堿、西藥亞胺培南同時使用時，二者的抗菌能力均有明顯提高，對95%耐藥菌株均表現出良好抑菌作用。Bardbari AM等[13]研究結果顯示，頭孢他啶、氨芐西林與黃連提取物同時使用應用于臨床治療，可使患者血液培養陽性率明顯降低。既往研究證實，加用黃連提取物可促進頭孢菌素、氨芐青霉素應用于銅綠假單胞菌感染大鼠治療的效果得到明顯提高。本研究結果均與這些研究結果保持良好一致性，均表明鹽酸小檗堿與抗菌西藥聯合使用能夠產生協同作用，促進藥物療效得到明顯提高[14-15]。

綜上所述，與單獨用藥相比，聯合使用亞胺培南、鹽酸小檗堿兩種藥物能夠獲得更理想抗菌效能，提高對銅綠假單胞菌的抑制作用，該方案應用于耐碳青霉烯銅綠假單胞菌臨床治療有望獲得更理想效果。