脂聯素對骨形成的調節及其機制的研究新進展

萬麗娟 龔燕平 祖 源 李春霖

解放軍總醫院南樓內分泌科，北京 100853

近年來脂肪組織分泌的各種細胞因子越來越受到研究者的關注，如瘦素、脂聯素、腫瘤壞死因子等，這些脂源性細胞因子對糖代謝、動脈粥樣硬化、炎癥、胰島素抵抗等方面產生關鍵性作用。脂聯素是一種具有保護作用的脂肪源性的細胞因子，是體內唯一與體質含量呈負相關的脂肪因子，近年來的研究發現其與骨代謝關系密切。本文就近年來有關于脂聯素骨調節的作用及其機制的研究綜述如下。

1 脂聯素概述

在1995年，Scherer等[1]率先發現了由脂肪細胞分泌的脂聯素，并因其分子量為30kDa將其命名為Acrp30。之后發現脂聯素由定位于3q27的APM1基因編碼，其基因長度為16kb，由2個內含子及3個外顯子構成[2]。247個氨基酸組成了脂聯素的一級結構，包括N端的信號序列、高度可變區、膠原蛋白區及C末端的球狀結構域。脂聯素與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、補體C1q及膠原蛋白在結構上有同源性，提示脂聯素的起源與TNF-α密切相關。

人血漿中的脂聯素水平高達0.5～30mg/L其總量占蛋白總量的0.01%，其中血漿中的脂聯素有三種存在形式，分別為三聚體、六聚體及多聚體，在血液循環中脂聯素絕大部分以多聚體形式存在（大約占85%），是具有生物活性脂聯素的主要存在方式[3-4]。脂聯素在結構上可分為小球狀片段型脂聯素及全長型脂聯素，這兩種不同結構的脂聯素通過不同的脂聯素受體、作用于機體不同的組織來發揮其的生物學作用。Waki H等[5]研究發現小球狀片段型脂聯素是由中性粒細胞和（或）單核細胞激活后分泌產生的白細胞彈性蛋白酶裂解全長型脂聯素而得來的。

2003年，Yamauchi等[6]采用分子克隆技術克隆出了兩種脂聯素受體的異構體，分別為脂聯素受體1（AdipoR1）與脂聯素受體2（AdipoR2），它們均屬于七次跨膜的受體家族，但它們與經典的七次跨膜的G蛋白偶聯受體不同，脂聯素受體的C端位于細胞膜外，且AMP蛋白激酶（AMPK）通路是它們主要的信號轉導通路。早期的研究發現為AdipoR1在骨骼肌細胞存在表達，而AdipoR2在肝細胞存在表達，胰島素β細胞及內皮細胞等均表達AdipoR1與AdipoR2這兩種受體[6]。近年來的研究發現為脂聯素這兩種受體在全身多種組織細胞廣泛表達，如脂肪組織、肝、腎、腦、肺、睪丸、骨骼肌、成骨細胞及破骨細胞等，并且其表達存在組織差異。鈣粘蛋白-T（T-cadherin）是最近發現的一種脂聯素新型受體，其與脂聯素結合后激活細胞內的信號轉導通路從而發揮生物學作用。

2 脂聯素促進成骨細胞增殖分化的作用及可能機制

2.1 脂聯素有促進成骨細胞增殖的作用

2004年，Berner等首次[7]應用免疫組化的技術在人離體的成骨細胞以及小鼠的體顎骨中檢測到了脂聯素，并驗證了人體脛骨及股骨培養的原代成骨細胞和小鼠的成骨細胞系MC3T3-E1中均存在脂聯素mRNA的表達，脂聯素mRNA的表達和分泌與成骨細胞的分化階段有關。同時從人骨中提取的原代成骨細胞培養觀察到了AdipoR1和AdipoR2的表達，AdipoR1在小鼠成骨細胞系MC3T3-E1中也存在表達。Oshima K等[8]發現脂聯素可以提高成骨細胞系MC3T3-E1堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的mRNA表達及其礦化的活性；將具有活性的脂聯素注射到實驗組小鼠體內，發現松質骨的體積明顯高于對照組，骨小梁骨礦物質含量（Bone Mineral Content，BMC）增加，提示了脂聯素有促進成骨細胞增殖，并提高其活性的作用。

2.2 脂聯素促進成骨細胞增殖的作用機制

Luo X等[9]研究發現脂聯素通過誘導激活p38絲裂原的活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）及c-Jun的氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK），促進成骨細胞的分化與增殖，增強ALP的活性，提高血漿1型膠原氨基端前肽（Procollagen I N-terminal Propeptide，P1NP） 與骨鈣素（osteocalcin，OCN）的生成量，增加骨髓基質的礦化量。P38 MAPK的阻斷劑SB203580可以使脂聯素誘導ALP的活性增加受阻；JNK的阻斷劑SP600125預處理可以使脂聯素誘導的成骨細胞分化增殖受阻；而AdipoR1的小干擾RNA則同時有以上兩種阻斷作用。因此脂聯素受體/JNK信號途徑介導了成骨細胞的增殖，脂聯素受體/p38MAPK信號途徑介導了成骨細胞的分化。此外，有研究[10]發現重組脂聯素對人成骨細胞RANKL的誘導及骨保護素（osteoprotegerin，OPG）mRNA的抑制呈劑量與時間依賴性，AdipoR1的siRNA可以消除脂聯素調控的RANKL及OPG mRNA的表達。MAPK信號通路在重組的脂聯素誘導RANKL激活及抑制OPG的表達中也起著重要的作用。

骨形態發生蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）對成骨細胞分化及骨生成起重要作用。有研究者發現，脂聯素在體外培養的成骨細胞中可通過AdipoR1促進BMP-2 mRNA的表達，但不能使BMPs的其他家族成員表達增加；5’-AMP激活性蛋白激酶 (5’-AMP-activated protein kinase，AMPK)的siRNA及AMPK抑制劑可抑制脂聯素介導的成骨細胞BMP-2的表達；加入特異性p38/NF-κB抑制劑或使p38/NF-κB突變， 脂聯素誘導的BMP-2表達可被抑制。因此脂聯素通過AdipoR1激活AMPK，p38/NF-κB通路促進成骨細胞BMP-2生成，可能是脂聯素促進成骨分化和生成的機制之一[11]。

2.3 脂聯素在模型動物和臨床研究中的作用存在爭議

對于脂聯素基因敲除/過表達模型動物的研究結果，目前并不完全一致。Mitsui[12]等對高表達脂聯素的轉基因小鼠的研究顯示，12周時模型鼠的骨密度和骨形成明顯增加。Wu Y等[13]的研究顯示，脂聯素基因敲除鼠的骨小梁結構和骨密度明顯降低。腦室注射脂聯素后，小鼠灰色脂肪組織的解耦聯蛋白（uncoupling protein 1，UCP1）表達明顯減少，血漿腎上腺素和去甲腎上腺素的水平明顯下降，神經元亮氨酸拉鏈蛋白結構（leucine zipper motif -1，APPL-1）表達增加，骨小梁體積在脂聯素基因敲除鼠和對照鼠中均增加。脂聯素有促進骨髓基質細胞和間質細胞向成骨細胞的分化的作用。而Ealey[14]等的研究認為，脂聯素過表達小鼠的股骨BMC和股骨頸峰值骨含量明顯低于對照小鼠。Williams GA的研究顯示，與對照鼠比較，雄性脂聯素基因敲除鼠的骨小梁容積增加約30%，骨小梁數量增加了38%。Wang F等[15]對脂聯素基因敲除鼠的研究發現，其成骨細胞的RunX2和Osterix的表達明顯增加；骨髓間質細胞向成骨細胞的分化和細胞鈣化明顯增加。對于這一矛盾結果的產生的原因，目前尚不明確。但有學者認為[16]，基因敲除/過表達鼠存在除骨骼外多個器官組織功能的改變，尤其是脂肪組織，而脂肪組織調節的脂肪代謝對骨代謝的影響是不容忽視的；此外基因改變后小鼠的破骨細胞的功能也相應發生改變，成骨/破骨的平衡被打破。因此對脂聯素基因敲除/過表達模型骨骼的改變及機制有待更多的研究證據證實。

數個臨床研究的結果也并不理想。Tenta R等[17]對81位絕經后女性（其中43位為低骨量）的研究并未發現脂聯素與BMD之間的關聯。MohitiArdekani J 等[18]對81位非糖尿病的骨質疏松患者的研究顯示，血漿脂聯素水平與股骨頸和脊柱BMD呈負相關關系。Wu 等[19]對336位絕經后中國女性的血漿脂聯素水平、BMD和骨轉化指標的研究顯示，脂聯素水平與BMD成負相關。設計更為合理的臨床研究，尤其是前瞻性研究，更有效的避免糖尿病、甲狀腺疾病、性別、年齡、藥物等因素對骨質疏松評估的影響，對于進一步研究脂聯素在人體對骨骼的影響就顯得尤為重要。

本研究也對脂聯素與小鼠骨折修復的關系進行了研究。我們的研究發現，骨折后局部應用脂聯素可以促進骨痂的生長，骨折的愈合。Western blot顯示局部應用脂聯素后，骨折局部BMP2水平的增高是其可能機制之一，但小鼠血漿的脂聯素和BMP2的水平并沒有明顯差異。因此我們認為，脂聯素確實有促進骨生成的作用，但作用的時機、療程和部位都有可能對其作用產生很大的影響。這也可以解釋為何脂聯素基因模型鼠和人體臨床觀察試驗的結果并不理想。我們已經在進行小鼠全身應用和局部應用脂聯素對骨折修復作用的比較（相關的文章整理投稿中），希望為脂聯素對成骨的作用機制提供更多理論依據。

3 脂聯素對破骨細胞的雙向調節作用及可能機制

3.1 脂聯素抑制破骨細胞的作用及其機制

2005年Oshima K等[8]發現，將具有活性的脂聯素注射到實驗組小鼠體內，除了有促進成骨增殖的作用，還同時伴有破骨細胞數量的減少，脂聯素可以抑制破骨細胞的增殖與活化。Wang QP等[20]對脂聯素基因敲除鼠的研究顯示，與對照鼠比較，模型鼠的破骨細胞數目較少，骨密度、骨小梁數目和骨容量更高，RANKL水平較低，而骨保護素（OPG）的水平更高。因此認為脂聯素可通過OPG/RANKL途徑抑制破骨細胞作用。Luo E等[21]的研究顯示，脂聯素抑制破骨細胞分化的作用與作用時間關系密切。持續給予脂聯素16天以上，破骨細胞的增殖和重吸收功能被明顯抑制。對破骨細胞增殖基因的抑制，以及對凋亡基因的上調，是脂聯素抑制破骨細胞的可能機制。YG等[22-24]應用APPL1的特異靶位小干擾RNA發現，脂聯素通過APPL1下調Akt1的活性，對破骨細胞的骨吸收產生抑制作用。Yamaguchi N等[25]的研究顯示，腦室注射脂聯素后，脂聯素基因敲除鼠和對照鼠的破骨細胞數量、破骨細胞生成標志降低，而骨小梁體積增加。中樞應用脂聯素不僅有促進骨髓基質細胞和間質細胞向成骨細胞分化的作用，而且有抑制破骨細胞分化的作用。

3.2 脂聯素對破骨細胞分化的抑制作用及其機制

此外，脂聯素還可以抑制單核細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）及RANKL誘導的小鼠骨髓巨噬細胞及人CD14陽性單核細胞向破骨細胞的分化，并抑制破骨細胞骨吸收的活性。有研究證實脂聯素可以抑制RANKL誘導的RAW264.7細胞向破骨細胞的轉化，并下調RANKL的上游調控基因，包括激活性T細胞的細胞核因子2（nuclear factor of activated T cells 2，NFAT2），腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6），組織蛋白酶K（cathepsin K），及酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，ACP）[24]。Wu Y等[13]發現脂聯素使RAW264細胞的Toll樣受體所介導的NF-κB活化受阻，從而抑制了破骨細胞的形成。

3.3 脂聯素對破骨細胞的促進作用及其機制

Luo X等[10]發現脂聯素誘導人成骨細胞RANKL表達，阻斷OPG表達的作用，對破骨細胞有間接的促進作用。進一步在成骨細胞及外周血單核細胞的共培養體系中加入MAPK抑制劑SB203580進行預處理，結果SB203580阻斷了脂聯素調節的RANKL及OPG mRNA的作用，抑制了破骨細胞的形成。提示脂聯素對破骨細胞的作用可能是雙向的。重組脂聯素有可能通過AdipoR1/ p38-MAPK蛋白通路誘導破骨細胞的增殖和分化[9]。Wang F等[15]對脂聯素基因敲除鼠的研究發現，其成骨分化和鈣化明顯增加，但并未發現模型鼠有明顯骨密度的改變，而模型鼠的堿性磷酸酶活性和破骨細胞數量也明顯增加。卵巢切除也不影響脂聯素基因敲除鼠的骨密度、堿性磷酸酶活性和破骨細胞數量。因此認為脂聯素有同時促進成骨細胞和破骨細胞分化增殖的作用，對調節骨形成和骨吸收平衡起著重要作用，對絕經后的骨骼保護有重要作用。Lubkowska A等[26]對脂聯素與骨密度關系的相關動物和臨床研究進行了總結，認為脂聯素對破骨細胞的作用及其對骨密度的影響，存在很多的爭議，有待進一步的研究證實。

4 脂聯素間接影響骨形成分化的內分泌代謝機制

研究表明，脂聯素對骨生成的作用不僅僅只通過通過旁分泌和自分泌途徑，而且還通過內分泌代謝途徑來影響骨生成：骨組織局部生成的脂聯素通過旁分泌或自分泌的代謝途徑來促進骨生成，而血液循環中的脂聯素通過內分泌的代謝途徑抑制骨生成。

脂聯素是調節代謝和胰島素敏感性的重要脂肪因子。脂聯素通過促進胰島素的磷酸化信號這一特定途徑可對骨生成起積極作用。有研究[27]顯示，脂聯素基因缺陷型的純合子小鼠的骨髓干細胞的促進骨生成的作用明顯低于野生型的小鼠；在培養骨髓干細胞的培養液中加入胰島素以后，可部分糾正脂聯素基因缺陷組骨髓干細胞的生長抑制。研究認為脂聯素促進了胰島素誘導的胰島素受體底物-1及Akt下游區分子的磷酸化作用，脂聯素通過影響胰島素信號轉導通路間接的促進了骨生成。Liu L等[28]的研究進一步發現，siRNA敲除成骨細胞中的PPARγ或AdipoR1后，可以阻止與3T3-L1細胞共培養的成骨細胞中的RunX2 mRNA的表達的減弱。而RunX2對成骨細胞的發育與骨形成不可或缺，是轉錄因子Runt結構域家族的成員[29]。共轉染PPARγ會降低成骨細胞RunX2和堿性磷酸酶的活性。研究認為脂聯素與其受體結合使MAPK及PPARγ配體的活性增加，從而使葡萄糖攝取及脂肪酸氧化增加，良性調節了骨的能量代謝，促進骨生成。因此，脂聯素可能通過脂肪細胞PPARγ對成骨細胞的調節起重要作用。

此外，還有研究顯示脂聯素可通過MAPK信號通路轉導途徑使造血干細胞增加并使其功能受到影響，調節間充質細胞的分化成熟，抑制骨髓前脂肪細胞分化為脂肪細胞的過程[30-31]。脂聯素可以通過中樞和周圍神經的作用機制來抑制破骨細胞的分化，促進骨髓間充質干細胞（bone marrow derived stroma cells，BMSCs）向成骨細胞的轉化，從而促進骨生成[32]。

綜上所述，脂聯素為脂肪細胞分泌的一種細胞因子，對骨形成的調節起著重要作用。脂聯素及其受體在成骨細胞和破骨細胞均存在表達，并通過自分泌、內分泌或旁分泌的作用機制來影響成骨細胞與破骨細胞的活性及分化。脂聯素作用的不同部位、療程和時機，有可能導致了脂聯素對骨代謝平衡調節的不同，成骨和破骨的作用相輔相成。脂聯素調節成骨和破骨細胞的可能信號通路總結見圖1。脂聯素對調節骨代謝平衡有著重要作用。深入地研究脂聯素促進骨形成的作用及調節機制將有助于更進一步了解脂聯素與骨生成的關系，并可能為臨床上與骨生成相關的疾病，如骨折，骨質酥松癥等的治療提供新的臨床思路及臨床途徑，以指導臨床上的治療。

圖1 脂聯素調節成骨和破骨細胞的可能信號通路

ACP：酸性磷酸酶 （tartrate-resistant acid phosphatase）；ALP： 堿 性 磷 酸 酶（alkaline phosphatase）；AMPK：5’-AMP激活性蛋白激酶（5’-AMP-activated protein kinase)；BMP-2：骨 形態 發 生 蛋 白 -2（Bone morphogenetic protein-2）；Cathepsin: 組織蛋白酶; JNK: c-Jun的氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase）；M-CSF：單核細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor）；MAPK：p38絲裂原的活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase）；NFAT2：激活性 T細胞的細胞核因子2（nuclear factor of activated T cells 2）；OCN：骨 鈣 素（osteocalcin）；OPG：骨 保 護素（osteoprotegerin）；P1NP：1型膠原氨基端前肽（Procollagen I N-terminal Propeptide）；TRAF6：腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6）。