PRDX3在姜黃素減輕布比卡因誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制研究

蘇懷軒 樊友凌 江偉航 潘杰慈 黃政通

廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 511400

布比卡因（bupivacaine）是一種氨基酰胺類的局部麻醉藥[1]，常用于臨床局部麻醉和止痛，但有報(bào)道顯示布比卡因會(huì)引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡[2]，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，進(jìn)而造成患者運(yùn)動(dòng)或感覺(jué)障礙，嚴(yán)重影響了患者生活。隨著局麻藥在臨床手術(shù)中廣泛的使用，其周圍神經(jīng)毒性逐漸引起人們的重視，其中以短暫神經(jīng)綜合征（transient neurologic syndrome，TNS）、馬 尾 綜 合 征（caude equina syndrom，CES）最為常見(jiàn)。局麻藥神經(jīng)損傷的防治成為臨床麻醉中的重要課題。姜黃素是一種低分子量的多酚化合物[3]，是中藥姜黃的主要活性成分，具有多方面的藥理作用[4]。SH-SY5Y細(xì)胞是人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，被廣泛運(yùn)用于構(gòu)建神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制和預(yù)防治療手段[5]。

抗氧化蛋白PRDX3屬于硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶家族[6]，位于線粒體基質(zhì)，主要作用是清除線粒體內(nèi)過(guò)氧化物，在細(xì)胞抗氧化防御體系及維持線粒體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。

本科研小組通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了布比卡因損傷人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞模型[8]，發(fā)現(xiàn)姜黃素預(yù)處理12h能減輕布比卡因所致的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡[9]，并通過(guò)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力和凋亡率等指標(biāo)的變化明確姜黃素的神經(jīng)保護(hù)作用[10]，同時(shí)通過(guò)對(duì)線粒體途徑介導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究探討抗氧化蛋白PRDX3的作用及其可能機(jī)制，發(fā)現(xiàn)PRDX3的高表達(dá)可能是導(dǎo)致這一保護(hù)作用的機(jī)制，為臨床防治局麻藥神經(jīng)損傷提供了新的理論依據(jù)和方法。

1 資料與方法

1.1 儀器與材料

（1）儀器

FACSsort流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司），BX260型熒光顯微鏡、CK30 型倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）；Sunrise RC+TW型遙控酶標(biāo)分析儀（奧地利Tecan 公司）。

（2）細(xì)胞株

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。

（3）試劑和藥品

姜黃素、布比卡因、MTT、Hoechst33258 熒光染料（美國(guó)sigma公司）；

1.2 方法

（1）SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細(xì)胞在含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基、5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)。

（2）布比卡因損傷人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞模型的構(gòu)建

體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，設(shè)置布比卡因濃度梯度，分為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mM 組，MTT 檢測(cè)細(xì)胞活力，確定布比卡因?qū)H-SY5Y的損傷的IC50值，本實(shí)驗(yàn)中我們選擇1.5mM布比卡因建立SHSY5Y細(xì)胞損傷模型。

（3）實(shí)驗(yàn)分組

將細(xì)胞按照條件不同分為四組：（1）空白對(duì)照組（con）：未經(jīng)過(guò)處理的；（2）模型對(duì)照組：加入1.5mM 布比卡因孵育 24h（B）；（3）1μM 姜黃素預(yù)處理 12h（C）；（4） 1μM 姜黃素預(yù)處理 12h后，加入1.5MM布比卡因孵育24h（C+B）。

（4）MTT法測(cè)定細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，計(jì)數(shù)后細(xì)胞懸液按每孔100μL加入96 孔培養(yǎng)板。48h 后，在有或沒(méi)有布比卡因的培養(yǎng)液中繼續(xù)孵育4h，每孔加入MTT溶液（5g/L）20μL，再繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸出上清，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10min，使沉淀充分溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞活力。

（5）流式細(xì)胞（FCM）檢測(cè)各組SH-SY5Y 細(xì)胞凋亡率

流式細(xì)胞儀（FACSsort，美國(guó)Becton Dinkinson公司）檢測(cè)，CellQuest 軟件分析細(xì)胞凋亡率。

（6）Hoechst33258 熒光染料染色觀察細(xì)胞核形態(tài)的改變

（7）逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)PRDX3 mRNA水平變化

采用Trizol一步法分別提取上述四組里SHSY5Y細(xì)胞的總RNA。結(jié)果觀察：分別取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物加樣至1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用GDS 凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝結(jié)果。

（8）Western blot 檢 測(cè) PRDX3，Bax，Bcl-2，caspase-9等蛋白表達(dá)量變化

蛋白質(zhì)提取，BCA法蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體標(biāo)記，曝光等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 布比卡因抑制SH-SY5Y細(xì)胞活力和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，分為六組，對(duì)照組未經(jīng)藥物處理，SH-SY5Y 與不同濃度（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mM）的布比卡因一起培養(yǎng)24h，這五組記為 B0.5，B1.0，B1.5，B2.0，B2.5。MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示布比卡因處理24h后，各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中不同濃度的布比卡因?qū)H-SY5Y細(xì)胞活力均有影響，具有顯著抑制作用，細(xì)胞活力的降低與布比卡因濃度的增加呈正相關(guān)。B0.5～B2.5組別細(xì)胞活力分別下降至85%，72%，50%，42%和24%（見(jiàn)圖1）。檢測(cè)及計(jì)算后得知，布比卡因誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的IC50值為1.48mM，因此本實(shí)驗(yàn)選擇布比卡因濃度為1.5mM建立神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

布比卡因處理24h后，經(jīng)Hoechst33258 熒光染料染色，可見(jiàn)具有凋亡征象的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)變圓、變小、收縮，胞核深染、固縮，細(xì)胞質(zhì)也出現(xiàn)收縮現(xiàn)象。對(duì)照組正常細(xì)胞則細(xì)胞膜完整、光滑，細(xì)胞核正常。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)布比卡因處理后的細(xì)胞凋亡率顯著提高，稀薄凋亡率和布比卡因的濃度呈正相關(guān)，空白對(duì)照組凋亡率為5.01%，B0.5～B2.5組別細(xì)胞凋亡率分別為19.22%，25.34%，38.18%，52.56%和65.17%，見(jiàn)表1。

因此，我們發(fā)現(xiàn)布比卡因?qū)H-SY5Y細(xì)胞有損傷作用，濃度升高，損傷程度加深。選擇1.5mM濃度布比卡因建立細(xì)胞模型。

圖1 布比卡因?qū)H-SY5Y細(xì)胞活力的抑制作用

表1 不同濃度布比卡因?qū)H-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（± s）

表1 不同濃度布比卡因?qū)H-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（± s）

布比卡因濃度（mM） n 凋亡細(xì)胞百分比（%）0 3 5.01±1.23 0.5 3 19.22±1.68 1.0 3 25.34±5.12 1.5 3 38.18±4.35 2.0 3 52.56±2.98 2.5 3 65.17±4.19 F 64.428 P 0.000

2.2 姜黃素減輕布比卡因?qū)H-SY5Y細(xì)胞活力的抑制和細(xì)胞凋亡率

體外培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞，分為如下幾組：對(duì)照組Con（未經(jīng)任何處理的細(xì)胞），B組（布比卡因濃度 1.5mM），B+C0.5，B+C1.0，B+C2.0，B+C5.0，B+C10.0（布比卡因處理細(xì)胞之前加入姜黃素預(yù)處理12h，姜黃素濃度分別為 0.5，1.0，2.0，5.0，10.0μM。姜黃素對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組SH-SY5Y細(xì)胞活力均有影響（見(jiàn)表2）。其中低濃度組別1μM姜黃素明顯減少了布比卡因?qū)е碌募?xì)胞活力降低，高濃度組別姜黃素對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞有毒害作用，無(wú)保護(hù)作用。確定姜黃素濃度為1μm作為后續(xù)試驗(yàn)濃度。

姜黃素預(yù)處理后的細(xì)胞凋亡率約為20%，而不加姜黃素的布比卡因損傷細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率為30%（見(jiàn)表3）。以對(duì)照組細(xì)胞活力為100%，姜黃素處理的相對(duì)細(xì)胞活力約為89%，而布比卡因組細(xì)胞活力為71%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)表2），根據(jù)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞活力數(shù)據(jù)的對(duì)比證明，姜黃素可以減輕布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷。

2.3 姜黃素預(yù)處理后，PRDX3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)

RT-PCR結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組相比，姜黃素預(yù)處理組（B+C）SH-SY5Y細(xì)胞PRDX3轉(zhuǎn)錄水平 略有下調(diào)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而布比卡因單獨(dú)處理組（C）PRDX3 mRNA水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)圖2）。

表2 不同濃度姜黃素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

表3 姜黃素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響（± s）

表3 姜黃素對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響（± s）

布比卡因濃度（mM） （μM） n 凋亡細(xì)胞百分比（%）0 0 3 9.67±3.52姜黃素濃度1.5 0 3 34.51±5.55 1.5 1.0 3 19.54±6.98 0 1.0 3 12.67±4.33 F 18.246 P 0.000

圖2

2.4 姜黃素預(yù)處理后，PRDX3蛋白質(zhì)表達(dá)量增高

Western 印跡結(jié)果顯示：與對(duì)照組（con）相比，姜黃素預(yù)處理組（B+C）SH-SY5Y細(xì)胞表達(dá)PRDX3略有減少，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而布比卡因單獨(dú)處理組（C）PRDX3蛋白水平明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)圖3）。

圖3

3 討論

在本研究中，我們展示了姜黃素在布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中的保護(hù)作用。用1μM姜黃素預(yù)處理顯著增加布比卡因處理的細(xì)胞中的PRDX3的蛋白表達(dá)量和Akt磷酸化。我們的研究結(jié)果表明，姜黃素通過(guò)PRDX3和Akt磷酸化水平依賴性機(jī)制減弱布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[11]。姜黃素可能是臨床上應(yīng)用局麻藥引起神經(jīng)毒性的潛在神經(jīng)保護(hù)劑。

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（例如SH-SY5Y）與真正的神經(jīng)元細(xì)胞不同，具有明顯的腫瘤細(xì)胞特征。 因此，SH-SY5Y細(xì)胞被廣泛用于研究局麻藥的神經(jīng)毒性[12-13]，因?yàn)樗鼈兛梢阅M神經(jīng)元的生物學(xué)特性。 因此，SH-SY5Y細(xì)胞被用于我們的神經(jīng)元損傷的體外模型。 布比卡因濃度為1.5mM，等于0.045%，用于本研究[14]。雖然此濃度不在臨床使用的濃度范圍內(nèi)，但1.5mM布比卡因能顯著誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，形態(tài)學(xué)變化和MTT測(cè)定結(jié)果已證明這一點(diǎn)[15]。我們的結(jié)果與之前的報(bào)道一致，布比卡因主要通過(guò)誘導(dǎo)壞死和凋亡來(lái)引發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞損傷[16]。

姜黃素已用于中醫(yī)數(shù)千年，一般認(rèn)為是安全的。在這項(xiàng)研究中，我們觀察到當(dāng)SH-SY5Y細(xì)胞用它預(yù)處理12h時(shí)，1μM（大約0.4mg/mL）的姜黃素沒(méi)有任何細(xì)胞毒性并且阻止了布比卡因的毒性。當(dāng)濃度增加到2，5，10μM時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)姜黃素對(duì)布比卡因誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的神經(jīng)保護(hù)作用減弱或甚至消失。數(shù)據(jù)表明姜黃素對(duì)布比卡因毒性的保護(hù)作用是劑量依賴性的，需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定姜黃素的細(xì)胞毒性作用的相對(duì)貢獻(xiàn)。總之，我們的結(jié)果表明，低濃度的姜黃素預(yù)處理12h將有利于預(yù)防布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。

抗氧化蛋白PRDX3屬于Peroxiredoxin抗氧化蛋白超家族，它是線粒體特有的過(guò)氧化物酶，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后，轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，依賴硫氧化蛋白還原過(guò)氧化物在線粒體基質(zhì)內(nèi)清除線粒體過(guò)氧化物，從而減少ROS產(chǎn)生。已有研究證明，線粒體內(nèi)ROS的增加與局麻藥布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)損傷關(guān)系非常密切。我們的研究證明姜黃素能增強(qiáng)抗氧化蛋白PRDX3（Peroxiredoxin3）的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，姜黃素能夠激活PRDX3表達(dá)，PRDX3表達(dá)水平增高后，細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的氧自由基分子被清除，布比卡因誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減少。我們發(fā)現(xiàn)姜黃素的抗氧化應(yīng)激作用通過(guò)增強(qiáng)PRDX3蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

已知與正常細(xì)胞相比，凋亡細(xì)胞通常具有顯著的線粒體膜電位去極化[17]。Dwm的丟失是線粒體相關(guān)的凋亡級(jí)聯(lián)中的關(guān)鍵早期事件，其導(dǎo)致線粒體通透性的轉(zhuǎn)變和細(xì)胞色素c和其他促細(xì)胞凋亡因子向胞質(zhì)溶膠的釋放[18-19]。因此，保持線粒體功能可以阻止線粒體依賴性細(xì)胞凋亡的激活。我們猜測(cè)Dwn可能參與姜黃素的神經(jīng)保護(hù)作用，姜黃素可能減輕布比卡因誘導(dǎo)的Dwm損失。此外，Akt抑制可能消除了姜黃素對(duì)布比卡因誘導(dǎo)的Dwm損失的保護(hù)作用。

許多研究表明，Akt是PI3-激酶下游的關(guān)鍵激酶，在不同的細(xì)胞應(yīng)激條件下神經(jīng)元的存活和死亡途徑中起著關(guān)鍵作用[20-22]。先前的報(bào)道顯示布比卡因降低Akt的磷酸化水平并導(dǎo)致Na2細(xì)胞，人腎細(xì)胞和小鼠C2C12成肌細(xì)胞中的細(xì)胞損傷。相反，增加Akt的磷酸化水平可減弱布比卡因誘導(dǎo)的損傷[23]。在本研究中，我們觀察到布比卡因降低Akt的磷酸化水平并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這與以前的報(bào)道一致，即布比卡因誘導(dǎo)的人近端腎小管細(xì)胞凋亡與Akt活性的抑制有關(guān)[24]。我們觀察到Akt活化的阻斷降低了姜黃素對(duì)布比卡因挑戰(zhàn)的細(xì)胞保護(hù)作用。總之，我們的研究結(jié)果表明，激活A(yù)kt信號(hào)傳導(dǎo)介導(dǎo)了姜黃素對(duì)布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的神經(jīng)保護(hù)作用。總之，我們的研究結(jié)果表明用姜黃素預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞對(duì)布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性具有保護(hù)作用。

總而言之，這種細(xì)胞保護(hù)作用至少部分是通過(guò)增加PRDX3的蛋白表達(dá)量來(lái)介導(dǎo)的。如果我們從轉(zhuǎn)化的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的體外研究結(jié)果可以應(yīng)用于體內(nèi)的神經(jīng)元，那么這項(xiàng)研究提示了臨床工作者們將姜黃素作為潛在的治療布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的藥物的可能性。