抑制HIF-1ɑ對胰腺癌MIA-Paca2細胞輻射敏感性影響及相關機制研究

邵凌東 彭清琴 唐黎瑞 張雪清 李金鑾 吳君心

福建醫科大學附屬腫瘤醫院 福建省腫瘤醫院放療科，福建福州 350014

胰腺癌約占所有腫瘤發病率的3.2%；然而，由于其很高的死亡率，患病者中約有80.3%發生腫瘤相關死亡[1]，在歐美發達國家腫瘤相關死亡中高居第4位[1-2]。目前，臨床上僅15% ～ 20%的確診患者可進行手術切除治療，這使得胰腺癌的總體生存率很難提高。而這部分手術可切除的患者，中位生存時間僅為 15～23個月[3-4]，5年總生存＜20%[4]。通過聯合放射治療與化療提高胰腺癌的局部切除率、降低術后復發率并最終提高總生存率成為目前的研究熱點。研究表明[5]，在HIF-1ɑ表達較高的腺癌細胞株PC-3中，使用HIF-1ɑ抑制劑YC-1，可明顯下調HIF-1ɑ的表達，并進一步降低了血管內皮生長因子（VEGF）表達，從而抑制增殖和誘導凋亡。這也揭示了HIF-1ɑ/VEGF可以作為抗腫瘤治療的重要靶點。目前國內外尚缺少在胰腺癌中使用HIF-1ɑ/VEGF抑制劑的放射增敏研究。在本實驗中，通過HIF-1ɑ的抑制劑YC-1抑制HIF-1ɑ的表達進行體外實驗，觀察在輻射條件下胰腺癌MIA-Paca2細胞株的凋亡情況及對HIF-1ɑ和VEGF的表達水平的影響，為胰腺癌的放射增敏治療提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料及設備

人胰腺癌MIA-PaCa2細胞株由中國科學院上海細胞庫提供；YC-1購自英國Tocris公司；細胞凋亡試劑盒AnnexinV/PI來自美國BD公司；鼠抗人HIF-1ɑ單克隆抗體（H1alpha67）、鼠抗人VEGF單克隆抗體（VG1）購于美國Novus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及分組 人胰腺癌MIA PaCa-2細胞選用含10%胎牛血清（PANSera ES FBS）的DMEM高糖培養液，在含5%CO2（體積分數），20%O2的37℃培養箱內培養。待培養細胞至對數生長期后進行分組，分為對照組和實驗組。（1）空白對照組：加入生理鹽水5μL；（2）YC-1 組：加入濃度為 0.1μmol/μL 的 YC-1 5μL（終濃度 10ng/mL）；（3）輻射（RT）組：60Co-γ 射線 2Gy，單次照射；（4）YC-1+RT組：加入5μL YC-1作用24h后給予60Co-γ射線2Gy單次照射。

1.2.2 AnnexinV/PI染色觀察細胞凋亡 將處理后24h的MIA-PaCa2細胞調整至濃度為106個/mL，從中收集200μL。離心重懸后，加入Annexin-V-FITC。在每組細胞中加入PI后2min迅速檢測。同時以不加Annexin V-FITC及PI的一管作為陰性對照。

1.2.3 Western Blot法檢測MIA-PaCa2細胞HIF-1ɑ、VEGF的表達量 干預處理24h后收集各組細胞，使用蛋白裂解液（含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）提取總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度。取30～50μg的蛋白樣品，隨后進行SDSPAGE電泳分離，轉移到PVDF膜上，進行封閉；加入一抗H1alpha67（1：1000），VG1（1：1000），4 ℃ 過 夜；加入二抗后室溫孵育1～2h，TBST洗滌。使用ECL底物化學進行發光顯色，通過Bio-rad化學發光成像系統進行曝光分析。實驗均重復3次。

1.3 統計學處理

采用統計學軟件SPSS22.0對數據進行統計分析，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同處理方法對MIA-PaCa2細胞凋亡的影響

經檢測，RT組、YC-1組及聯合治療組的細胞凋亡率均高于空白對照組；而通過RT組誘導凋亡的效果強于YC-1組，但結果差異無統計學意義（P＞0.05），聯合治療組的凋亡率明顯高于其它處理組（P＜0.05）（見圖1）。

圖1 不同處理方法對MIA-PaCa2細胞凋亡的影響

2.2 不同方法處理后對MIA PaCa-2細胞HIF-1ɑ及VEGF蛋白表達量的影響

經過24h后，YC-1組HIF-1ɑ的表達降低，RT組HIF-1ɑ的表達高于YC-1組，且稍高于空白對照組。相較于空白組，YC-1組及單純RT組，YC-1+RT聯合治療組中HIF-1ɑ的表達降低。

單獨放療組中VEGF蛋白的表達高于空白對照組及YC-1組，同時YC-1組中，VEGF表達較空白對照組低。在YC-1及RT聯合治療組中，VEGF的表達低于RT組，并稍高于YC-1組及空白對照組（見圖 2）。

圖2 不同干預方式對MIA PaCa-2細胞HIF-1ɑ及VEGF蛋白表達量的影響

3 討論

HIF-1ɑ是HIF-1的活性亞基和調節亞基，在機體低氧適應和病理反應中起重要作用，是關鍵的氧調節亞基。研究發現在胰腺癌細胞中，HIF-1ɑ的含量與細胞的惡性生物學行為存在正相關[6-7]。Shibaji T等[7]針對胰腺癌的研究發現，HIF-1ɑ與腫瘤轉移、VEGF 表達及間質微血管密度（IMD）相關，可以用來評估預后。在已知的血管生成蛋白中，VEGF是作用最直接的可溶性促內皮細胞分裂素，同時也支持著血管內皮細胞的存活。國內外研究發，VEGF通過多種作用機制促進腫瘤血管生成并增強血液流通以持續供給腫瘤組織養分與氧氣[8]。在腫瘤乏氧的微環境中，HIF-1ɑ可上調VEFG表達，促進腫瘤血管生成。目前，拮抗VEGF的表達，降低其對微血管輻射損傷的保護，成為逆轉輻射抵抗的重要策略。

本研究中，選擇低表達HIF-1ɑ的胰腺癌細胞菌株MIA-PaCa2，通過輻射可上調HIF-1ɑ的表達。腫瘤微環境在電離輻射作用下產生乏氧條件，而在乏氧環境下HIF-1ɑ可穩定表達[9]。在腫瘤乏氧調節中，HIF-1ɑ具有中樞紐帶地位，其高表達與輻射抵抗相關[10]。通過檢測MIA-PaCa2細胞的凋亡情況可知，使用HIF-1ɑ抑制劑后，電離輻射引起的細胞凋亡及死亡率相較于未使用抑制劑組高。電離輻射通過直接或間接的方式損傷腫瘤細胞DNA，從而殺滅腫瘤細胞，然而，輻射可促進HIF-1ɑ的表達，提高腫瘤細胞的輻射抗性[11-12]。通過利用YC-1下調HIF-1ɑ的表達，能夠降低腫瘤細胞的輻射抵抗，并促進腫瘤細胞的凋亡及死亡。Akakura N等[6]研究者對20種人胰腺癌細胞株進行了實驗，發現其中75%人胰腺癌細胞株穩定表達HIF-1ɑ，且HIF-1ɑ在胰腺癌細胞抵抗乏氧和低糖誘導的凋亡中發揮重要作用。通過轉染 HIF-1ɑ也可以提高對凋亡的抵抗及增加體內的腫瘤生成，這與我們的研究結果相符。

在腫瘤乏氧的微環境中，HIF-1ɑ可上調VEGF表達，VEGF通過參與內皮細胞增殖、分裂和遷移過程并促進腫瘤血管生成[13-15]。Itakura J等[16]在人胰腺癌組織及胰腺癌細胞株中檢測VEGF的表達，證實胰腺癌細胞具有過表達 VEGF及其受體的能力，并發現其可以通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑促進胰腺癌生長主。本研究發現通過抑制HIF-1ɑ的表達，能夠使得VEGF的表達降低。經過輻射處理后的胰腺癌細胞VEGF表達上調。輻射也可通過上調HIF-1ɑ的表達，進而影響下游蛋白VEGF。在腫瘤的生長、侵襲和轉移過程中，VEGF都起著至關重要的作用，VEGF將是一個潛在的腫瘤治療靶點[15]。通過抑制HIF-1ɑ表達，可間接影響VEGF蛋白。在使用HIF-1ɑ抑制劑后進行輻射處理，MIA-PaCa2細胞VEGF的表達較直接輻射低。由此可見，使用HIF-1ɑ抑制劑可以逆轉輻射上調VEGF引起的輻射抵抗。

Zhao Q 等[5]研究者針對乏氧環境下下人胰腺癌細胞株PC-3進行了研究，發現其高表達HIF-1ɑ；通過利用HIF-1ɑ抑制劑YC-1，可明顯下調其表達，并進一步降低了VEGF表達，從而誘導胰腺癌細胞的凋亡并抑制其進一步增殖。前期體內外實驗研究證實，降低食管癌細胞中HIF-1ɑ及VEGF的表達可以提高輻射敏感性[17-18]。同時在一些惡性腫瘤患者中，HIF-1ɑ及VEGF與腫瘤患者的預后相關[19]，HIF-1ɑ還是抗表皮生長因子受體（EGFR）治療的預后指標[20]。不管是在體內還是體外，亦或是在人體組織中，關于胰腺癌HIF-1ɑ及VEGF與電離輻射相結合的研究相對較少。本研究在常氧條件下利用低表達HIF-1ɑ的胰腺癌細胞菌株MIA-PaCa2及電離輻射，驗證了電離輻射可以上調HIF-1ɑ及VEGF的表達。同時，抑制HIF-1ɑ可以提高輻射敏感性。

綜上所述，本研究通過觀察輻射與HIF-1ɑ抑制劑YC-1聯合應用對胰腺癌MIA-PaCa2細胞凋亡的影響及HIF-1ɑ、VEGF蛋白的表達情況，結果顯示電離輻射可促進HIF-1ɑ及VEGF蛋白表達；予YC-1處理后進行輻射處理，可逆轉輻射對HIF-1ɑ及VEGF的上調作用。YC-1聯合電離輻射能協同促進胰腺癌MIA-Paca2細胞凋亡， 其機制可能是通過抑制HIF-1ɑ，使VEGF表達下調，降低其對輻射損傷的保護作用，同時能夠誘導胰腺癌細胞的凋亡，提高放射敏感性。