慢性腎病并發慢性心血管損傷大鼠模型的建立

姚波，馬曉燕，張魯囡，王禹

1.解放軍總醫院，北京 100853；2.長春中醫藥大學 附屬醫院，吉林 長春 130021；3.北京衛戍區 海淀第三退休干部休養所，北京 100853

慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD）是威脅人類健康的重要疾病，全世界有超過200萬人患有終末期腎臟病[1-2]，需要依賴腎臟替代治療維持生命。大鼠CKD模型可促進人們對CKD發生機制的理解，并用于測試新藥。在大鼠飼料中添加腺嘌呤可誘導形成大鼠CKD模型。飼料中添加質量分數0.75% 的腺嘌呤便可導致腎臟損傷，具體表現為腎臟體積增大、結節樣外觀、凋亡性病損、70% ～80% 的腎臟組織纖維化、血漿尿素氮和血清肌酐升高、電解質代謝紊亂[3]和氧化應激。與人類CKD以年計的進展進度不同，大鼠CKD模型的這些改變均可在4周內出現。

作為一種嘌呤堿基，腺嘌呤是黃嘌呤氧化酶的產物，是體內尿酸的潛在來源之一[4]。尿酸是誘導氧化應激、CKD、高血壓、心肌肥大和炎癥的重要因素[5]，能夠導致心臟和腎臟損傷，在某些情況下還能導致終末期腎臟病[6]。本次研究的主要目的是明確腺嘌呤誘導CKD模型的腎臟和心臟結構及功能改變的特征，其次要明確應用別嘌呤醇降低尿酸濃度能否減輕大鼠對腺嘌呤的反應。經過劑量實驗、腎臟和心臟結構分析及功能學實驗，我們認為，應用質量分數為0.25% 的腺嘌呤誘導16周，能夠引發高尿酸誘導性的慢性腎臟損傷，這可能作為一種用于模擬人類CKD且伴有心血管并發癥的動物模型。

1 材料和方法

1.1 動物實驗

動物實驗流程和方法均通過解放軍總醫院動物福利委員會的審核。9～10周齡雄性Wistar大鼠（n=76，體重333±1 g）購自維通利華公司，分為7個實驗組，處理16周。第1組（對照組，n=12）飲食為大鼠粉末食料（維通利華公司）；第2～5組，向粉末食料中添加腺嘌呤（Carbosynth公司），使腺嘌呤質量分數分別為0.075% （n=10）、0.25% （n=12）、0.5% （n=10）或 0.75% （n=8）；第 6組給予0.25% 腺嘌呤16周，同時給予25 mg/（kg·d）別嘌呤醇（Sigma公司）（n=12）；第7組從第8～16周單獨給予25 mg/（kg·d）別嘌呤醇（n=12）。

1.2 收縮壓的測量

每4周測量1次大鼠的收縮壓，測量前靜脈注射給予Zoletil（替來他明15 mg/kg，唑拉西泮15 mg/kg）使動物輕度鎮靜。用MLT1010 Piezo-Electric Pulse Tranducer（ADInstrucments公司）及不可充氣的尾鉗（tail-cuff）與 MLT884 Physiologi?cal Pressure Transducer及Power Lab數據獲取單元（ADInstruments公司）測量并獲取數據[7]。

1.3 腎功能評估

16周飼喂結束后，將大鼠于代謝籠中飼養24 h，收集尿液用于蛋白、肌酐和尿素氮濃度的測量。收集尿液后，麻醉大鼠并收集血漿標本。測量血漿尿素氮、肌酐、尿酸、鈉、鉀、鈣、乳酸脫氫酶、總膽固醇、總甘油三酯及非酯化脂肪酸。計算肌酐清除率。

1.4 獲取離體的心臟

獲取血液標本后剪下大鼠的心臟，于0℃結晶灌注液中保存。在殘主動脈冠狀動脈口上方向主動脈內置入套管，進行心臟灌注，通過在左心室內置入乳膠球囊導管評估等容心室功能；導管與Capto SP844MLT844 Physiological Pressure Transducer and Chart軟件相連，用MacLab System和PowerLab數據獲取單元（ADInstruments公司）測量獲得數據。實驗結束后，解剖去除心房和右心室，留下左心室和室間隔，用紗布吸干，稱重。心肌舒張的順應性通過舒張順應性常數κ計算。

1.5 血管反應的器官浸浴實驗

胸主動脈弓（長度4 mm）置于器官浸浴小室，靜息張力為10 mN。測量去甲腎上腺素的累積濃度反應（收縮）曲線；在對去甲腎上腺素次峰值（～70% ）收縮存在的同時，測量乙酰膽堿和硝普納的濃度-反應（舒張）曲線。

1.6 組織病理學

獲得活體組織腎臟和心臟（左心室）以后，立即在10% 福爾馬林中固定，每天更換福爾馬林溶液。用酒精梯度對樣本進行脫水，在石蠟中固定。腎臟、左心室和肝臟做薄層切片（4 μm），蘇木素-伊紅（H ＆ amp;E）染色或Masson三色染色。進行過碘酸希夫染色（PAS），以觀察近端腎小管管腔刷狀緣的緩解。用ImagePro Plus圖像分析軟件進行圖像形態學分析。

1.7 免疫印跡

本研究中使用的一抗包括多克隆山羊TNF-α（1∶1000）、多克隆兔抗NF-κB p50（1∶1000）、多克隆兔抗 NF-κB p52（1∶1000）、單克隆兔抗TGF-β1（1∶1000）（SantaCruzBiotechnology 公司），以及多克隆兔抗PLA2（1∶1000）、單克隆小鼠抗HO-1（1∶1000）（Abcam公司）。

將腎臟皮質和髓質在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中勻漿。根據蛋白濃度確定電泳上樣量，各組上樣量保持一致，以GADPH（1∶5000，Sigma-Aldrich公司）作為對照，用ImageJ圖像分析軟件分析條帶濃度。

1.8 免疫組織化學染色

免疫組織化學染色使用的一抗包括單克隆小鼠抗ED-1（1∶150，Serotec公司）、單克隆小鼠抗α-SMA（1∶400，Sigma公司）。免疫組織化學染色在4 μm切片上采用常規操作進行。

1.9 統計學分析

數據以x±s表示，使用One way方差分析和Tukey檢驗，或Two way方差分析和Bonferroni檢驗，P＜0.05認為有統計學顯著差異。用Graph Pad Prism 5.0進行統計學分析。

2 結果

2.1 不同劑量腺嘌呤飼喂對大鼠體重的影響

0.75 % 腺嘌呤組大鼠攝食量保持恒定；0.075% 腺嘌呤組大鼠體重無明顯改變；16周時，與衰老相關的體重增加在0.25% 腺嘌呤組中更明顯；0.5% 腺嘌呤組大鼠體重無增長，0.75% 腺嘌呤組大鼠體重下降（圖1）。

圖1 不同質量分數腺嘌呤飼喂對大鼠體重的影響

2.2 不同劑量腺嘌呤飼喂對大鼠收縮壓和心臟結構的影響

0.25 % 、0.5% 和0.75% 腺嘌呤組大鼠的收縮壓顯著增加，但0.075% 腺嘌呤組增加的程度較輕（圖2A）。0.075% 腺嘌呤組大鼠的左心室結構無改變，但在高濃度腺嘌呤組中可觀察到明顯的纖維化和炎癥細胞浸潤（圖2B）。

圖2 不同質量分數腺嘌呤飼喂大鼠的血壓和心肌結構變化

2.3 0.25% 腺嘌呤對大鼠心血管功能的影響

0.25 % 腺嘌呤飼喂組大鼠的收縮壓從第4周開始升高，到第8周開始穩定。左心室剛性常數（stiffness constant）升高（32.9±1.4 vs.23.1±0.8），伴有心臟炎癥細胞浸潤及間質和血管周纖維化。在離體胸主動脈環中，去甲腎上腺素介導的收縮，內皮依賴乙酰膽堿介導的和平滑肌依賴硝普鈉介導的舒張受損（圖3）。血清甘油三酯、總膽固醇和非酯化脂肪酸升高（表1）。

圖3 腺嘌呤飼喂和別嘌呤醇治療后，去甲腎上腺素（A）介導的收縮，內皮乙酰膽堿（B）、平滑肌硝普鈉（C）介導的舒張功能變化

表1 不同劑量腺嘌呤飼喂對大鼠血漿指標的影響

2.4 不同劑量腺嘌呤飼喂對大鼠生化指標的影響

不同劑量的腺嘌呤飼喂大鼠后，血漿參數和蛋白尿程度在0.75% 腺嘌呤組大鼠中較其他組更高（表2）。腎臟病理切片中，單位面積內擴張的腎小管數、含有碎片的小管數、異常腎小球數、纖維化面積比例在0.75% 腺嘌呤組大鼠體內也有明顯升高（數據未示）。

2.5 應用別嘌呤醇治療0.25% 腺嘌呤誘導的大鼠抑制腎組織內多種蛋白表達

用25 mg/（kg·d）的別嘌呤醇治療0.25% 腺嘌呤飼喂大鼠至少8周，能夠降低血漿尿酸濃度，改善腎功能，表現為蛋白尿、肌酐、血漿尿素氮及清除率降低。結構上，小球損傷、炎癥和膠原沉積在別嘌呤醇治療后降低（數據未示）。別嘌呤醇治療后，腎臟 HO-1、TNF-α、PLA2、NF-κB p50、NF-κB p52和TGF-β的表達降低（圖4）。

3 討論

目前，科學家們廣泛接受的CKD動物模型是大鼠5/6腎切除模型[8]，這種模型能夠模擬人類腎臟疾病中腎小球濾過率下降、血清肌酐和尿素氮升高、體重降低[9]的病理改變，但存在死亡率高、腎臟結構和功能結局多變，以及剩余可用腎組織體積有限等缺點。其他CKD模型包括單側腎單次夾閉[10]、雙側腎單次夾閉、通過鏈霉素化學誘導糖尿病[11]和基因模型如糖尿病性肥胖db/db小鼠和ob/ob小鼠[12]。這些模型僅可復制一部分人類CKD的表現，無法完整地復制相應的表現。

飲食中添加腺嘌呤能夠誘導腎臟損傷，其主要表現為血清肌酐和血漿尿素氮濃度升高，以及肌酐和血漿尿素氮清除率下降[5]。早期的研究表明，0.75% 腺嘌呤飼喂能夠引起顯著且迅速的病理改變[13]。我們在劑量范圍研究中已確認了這一結果，反映在人類中，即為不常見的急性進展性腎臟損傷。本研究中，我們發現0.25% 腺嘌呤能夠在16周時誘導與人類CKD類似的慢性腎臟損傷。同時，我們也觀察到慢性炎癥細胞浸潤、纖維化程度升高、腎小管萎縮和擴張、腎小球損傷等病理改變，模型大鼠的血清脂質濃度也有所升高，這可能是由于腎臟損傷引起的代謝障礙所導致。0.25% 腺嘌呤飼喂的大鼠出現了高血壓和心室膠原沉積等癥狀，但無法確認腎臟損傷和心血管系統損傷是同時發生還是次序發生。第4周時收縮壓升高，尿試紙檢驗提示出現蛋白尿；第8周時收縮壓進一步升高，尿液中開始出現血液或白細胞，提示腎臟和心血管疾病同時進展。

表2 不同劑量腺嘌呤飼喂對大鼠生化指標的影響

圖4 腺嘌呤飼喂、別嘌呤醇治療后大鼠腎臟HO-1（A）、TGF-β（B）、TNF-α（C）、PLA2（D）、NF-κB p50（E）、NF-κB p52（F）的表達

腎臟和心血管反應的同時存在提示飲食中添加0.25% 腺嘌呤能夠克服許多其他CKD動物模型的缺點。相比于大鼠，小鼠可能對腺嘌呤更敏感，這還有待進一步的探討。

腺嘌呤誘導的腎臟損傷可能由血漿尿酸濃度升高所致。作為一種嘌呤堿基，腺嘌呤可能通過黃嘌呤氧化酶而成為尿酸的來源之一。血漿尿酸濃度在0.25% 腺嘌呤飼喂大鼠中升高，而在別嘌呤醇治療的大鼠體內下降。別嘌呤醇治療能夠改變0.25% 腺嘌呤飼喂大鼠的心臟和腎臟功能和結構，提示尿酸可能在心臟和腎臟病理改變中扮演主要角色。別嘌呤醇在db/db小鼠中也可改善腎臟功能并緩解小管間質纖維化損傷[14]。

另一個可能的參與機制是氧化應激本身。支持這種假設的證據之一是HO-1表達水平的升高。氧化物可以誘導腎小球選擇性下降，細胞表型喪失、凋亡[15]，內皮細胞損傷，脂質過氧化和炎癥細胞反應，氧化物濃度與下降的腎臟功能負相關。HO-1是人類腎臟疾病和實驗模型中針對氧化應激的關鍵防御機制，HO-1的表達與蛋白尿和小管間質改變的嚴重程度相關。HO-1在自由基介導的損傷腎臟中過表達。氧化物能夠引起足細胞損傷，而足細胞損傷是導致腎小球損傷和進一步硬化的關鍵因素。

慢性腎病并發慢性心血管損傷大鼠模型的建立，為今后腎病、心血管系統疾病的研究提供了一種新的動物模型，其科研潛力有待進一步發掘。同樣，由于該模型的各方面相關研究資料尚不多，其穩定性及代表性也有待考證。