CYP7A1基因啟動子克隆及螢光素酶報告基因載體構建

張照研，王宇光，高月

1.北京工業大學 生命科學與生物工程學院，北京 100124；2.軍事科學院 軍事醫學研究院 輻射醫學研究所，北京 100850

細胞色素 P450 7A1（cytochrome P450 7A1，CYP7A1）是細胞色素P450超家族的一個亞型，也稱膽固醇7α-羥化酶，屬于氧化還原酶類[1]。CYP7A1能將膽固醇轉化為7α-羥基膽固醇，是膽汁酸合成中的第一步和限速步驟。內源性膽固醇和膽汁酸水平可嚴格調控CYP7A1的基因表達，以維持上述2種成分的體內水平[2-7]，在膽酸和膽固醇代謝中起重要作用。因此，深入研究對CYP7A1具有調控作用的藥物和天然產物，對以膽固醇和膽酸代謝為特征的相關疾病治療具有重要價值。本研究旨在構建以CYP7A1基因啟動子為啟動序列的雙螢光素酶報告基因系統，為進一步研究中藥及其成分對CYP7A1的調控機制提供有效篩選模型。

1 材料和方法

1.1 材料

HepG2細胞購于中國醫學科學院基礎醫學研究所，由本實驗室凍存保種；大腸桿菌DH5α感受態細胞購于北京博邁德生物技術有限公司；限制性內切酶KpnⅠ和HindⅢ、T4DNA連接酶、DL2000和 DL10000 DNA marker、dNTP 混合物、10×緩沖液、ExTaqDNA聚合酶、pMD19-T質粒購于寶生物工程(大連)有限公司；LipofectAMINE 2000、TRIzol購于Invitrogen公司；PCR反轉錄試劑盒、小量質粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒購于天根生物技術公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購于普洛麥格（北京）生物技術有限公司；引物由北京博邁德生物技術有限公司合成；24孔細胞培養板購于Corning公司；酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉等試劑購于Oxford公司；DMEM培養基購于Gibco公司；胎牛血清購于Thermo Fisher Scientific公司；胰蛋白酶購于Sigma公司；青霉素鏈霉素雙抗溶液購于HyClone公司。

PCR儀、Victor X多標記酶標儀（Perkin Elmer公司）；電泳儀、電泳槽設備、成像系統（Bio-Rad公司）；3110細胞培養箱（Thermo公司）；Mi?crofuge 22R臺式高速離心機（Beckman公司)；Ax?iovert 40倒置顯微鏡（Zeiss公司）。

1.2 報告基因質粒的構建

1.2.1 目的片段獲得 從L02細胞中提取基因組DNA。設計CYP7A1啟動子PCR擴增引物，并分別引入KpnⅠ、HindⅢ酶切位點，根據啟動子ATG上游2100 bp序列及載體的多克隆位點信息，分別設計上游引物（GCGGTACCCCATCAGATCTCA TGAAATT，添加KpnⅠ酶切位點）、下游引物（GG ATCCCATGCATGATGCACATGCTA，添加HindⅢ酶切位點），擴增的啟動子位置為-2058～+2。

1.2.2 CYP7A1啟動子PCR擴增 PCR采用20 μL反應體系（反應條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，36個循環；72℃延伸 10 min）。取5 μL PCR產物加入1 μL 6×上樣緩沖液，用0.5% 的瓊脂糖凝膠電泳分析。將擴增產物回收純化，將擴增的啟動子片段插入pUC57，構建pUC57-CYP7A1-promoter。

1.2.3 重組質粒的構建及鑒定 將pUC57-CYP7A1-promoter與pGL3-Basic載體雙酶切，將2質粒的雙酶切產物分別回收純化后得到已含有粘性末端的載體和插入片段，用T4DNA連接酶于16℃低溫恒溫反應槽中連接16 h，得到重組質粒。將連接后的產物轉化大腸桿菌DH5α感受態，在不含氨芐青霉素的LB液體培養基中于37℃培養1 h后，涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂糖培養基上，37℃培養12 h，挑選陽性克隆擴增并提取重組質粒進行雙酶切鑒定，將重組質粒進行雙向測序拼接確定堿基序列，并進行Blast比對。

1.3 細胞轉染和熒光值檢測

1.3.1 細胞培養 完全培養基由含10% 胎牛血清、100 μg/mL青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養基構成，在37℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養箱中培養HepG2細胞，0.25% 胰酶消化傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.2 轉染和熒光檢測 采用轉染試劑Lipo?fectAMINE 2000進行。取對數生長期HepG2細胞，消化后計數，按每孔2.5×105細胞接種于24孔板中，當細胞密度達約80% 時用Opti-MEM培養液稀釋質粒。將500 ng pGL3-CYP7A1-promoterluc（采用測序無誤的質粒2、3分別進行實驗）、50 ng pRL-TK 內參質粒、2 μL LipofectAMINE 2000混勻；將500 ng pGL3-Basic、50 ng pRL-TK內參質粒、2 μL LipofectAMINE 2000混勻，設置為對照組；質粒與轉染試劑室溫孵育20 min，24孔板每孔加入100 μL混合轉染液，在細胞培養箱中轉染6 h，吸去混合液，換含2% 胎牛血清、不含青霉素鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養基，在37℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫培養箱中分別培養24、48 h，吸去各組培養液，PBS洗滌細胞1次，每孔加入100 μL 1×PLB溶液，室溫靜止裂解15 min，加入100 μL LABⅡ溶液，多功能酶標儀檢測各孔的螢火蟲螢光素酶活性；接著各孔加入100 μL Stop＆Glo試劑，啟動海腎螢光素酶反應后，檢測海腎螢光素酶活性，并計算熒光值比值。

圖1 CYP7A1啟動子擴增片段（2060 bp）凝膠電泳

圖2 pUC57-CYP7A1-promoter質粒構建示意圖

圖3 pGL3-CYP7A1-promoter-luc構建過程示意圖

1.4 統計學處理

實驗數據使用軟件SPSS 17.0進行統計學處理，多組數據間比較采用方差分析，兩兩比較采用t檢驗處理，P＜0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 CYP7A1啟動子擴增的凝膠電泳測定

結果見圖1。引物設計PCR的片段大小為2060 bp，PCR產物凝膠電泳顯示目的條帶約為2000 bp，與CYP7A1啟動子大小相符，表明成功擴增了CYP7A1的啟動子。對產物進行回收后再次PCR，膠回收產物。

2.2 質粒構建

pGL3-CYP7A1-promoter-luc質粒構建過程如圖2、3所示。首先將克隆載體pUC57-vector與PCR擴增的CYP7A1啟動子連接。之后，將構建的pUC57-CYP7A1-promoter與熒光載體pGL3-Basic vector用限制性內切酶KpnⅠ、HindⅢ雙酶切（圖4），回收2060 bp的CYP7A1啟動子片段，與pGL3-Basic載體用T4DNA連接酶連接，連接后轉化感受態大腸桿菌DH5α，挑單克隆振蕩培養，進行菌液PCR驗證（圖5），經氨芐青霉素篩選得到重組熒光質粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc，測序。雙酶切pUC57-CYP7A1-promoter與熒光載體pGL3-Basic vector結果顯示片段大小符合預期。菌液PCR結果表明，除泳道5、11外，均鑒定為陽性克隆質粒。測序比對發現構建的pGL3-CYP7A1-promoter-luc中的測序片段與CYP7A1啟動子一致。以上結果表明成功構建了熒光質粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc。

2.3 測序

構建質粒 pGL3-CYP7A1-promoter-luc2、3進行雙向測序，拼接后經Blast比對，序列與CYP7A1啟動子相同，測序結果顯示質粒構建成功（圖6）。

2.4 細胞轉染和螢光素酶活性測定

分別將pGL3-CYP7A1-promoter-luc2、3質粒轉染HepG2細胞，6 h后換含2% 胎牛血清的DMEM培養基，恒溫培養箱中培養24、48 h后檢測熒光，計算熒光值比值，分別與對照組（pGL3-Basicvector）進行組間t檢測。轉染pGL3-CYP7A1-promoter-luc2質粒24、48 h后，熒光響應值分別為對照組的13.1±2.8倍（P＜0.001）和23.3±2.9倍（P＜0.001）；轉染 pGL3-CYP7A1-promoterluc3質粒24、48 h后，熒光響應值分別是對照組的8.4±1.6倍（P＜0.001）和22.1±1.9（P＜0.01）倍；結果均有顯著性差異（圖7），表明質粒pGL3-CYP7A1-promoter-luc2、3均能響應。

3 討論

圖4 pUC57-CYP7A1-promoter和pGL3-Basic vector的雙酶切

圖5 瓊脂糖凝膠檢測菌液PCR擴增片段

圖6 質粒2測序示意圖（-20～175 bp）

圖7 螢光素酶活性測定

報告基因的表達產物為特定蛋白質或酶，可被檢測和鑒定，從而間接反映基因調控的效率和特異性。報告基因在表達過程中對細胞或動物正常的生理作用或活性沒有影響。常用的報告基因有螢光素酶基因、綠色和紅色熒光蛋白基因等[8]。報告基因法在病毒檢測和抗病毒藥物篩選等方面具有廣闊的應用前景[9-11]。本實驗室前期曾構建過CYP1A1、CYP2B6、CYP3A4等熒光報告基因載體，并對烏頭堿[12]、補骨脂[13]、人參皂苷[14]、麥冬皂苷[15]等成分進行篩選，發現了中藥的配伍以及中藥有效成分對藥物代謝酶的影響規律，為相關中藥的臨床應用提供了重要依據。筆者采用實驗室已構建的CYP3A4啟動子的熒光報告基因質粒對何首烏的成分進行篩選，發現其中成分具有上調和下調CYP3A4的作用，該研究為何首烏在臨床合理使用提供了實驗層面的參考[16-17]。

膽固醇7α-羥化酶是體內膽固醇轉化為膽汁酸的經典合成途徑的第一限速酶[18]，催化膽固醇為7α-羥化膽固醇。膽固醇轉化為膽汁酸是其代謝的主要途徑[19-20]。CYP7A1表達除受晝夜節律及基因多態性影響外，還可被激素、細胞因子等多種因素調控。其表達調控主要發生在轉錄水平，受到包括 FXR、HFN-4α、SHP、SREBP-1C、PGC-1α等諸多核因子調控。中藥及其方劑對調脂和降低膽固醇具有較好的療效。近來有轉錄組學研究表明，何首烏通過上調膽固醇和膽酸生物合成的關鍵酶CYP7A1從而產生肝損傷[21]。相比于轉錄組學通量大耗時長，螢光素酶報告基因系統具有檢測速度快、靈敏度高、結果確切等優點，在藥物篩選、疾病檢測等方面具有廣闊的應用前景。中藥方劑和有效成分能通過調控CYP7A1，調解體內膽酸和膽固醇的穩態，從而發揮降脂治療膽結石等藥效[22-26]。探討中藥及其成分對CYP7A1的調控方式十分重要，構建的CYP7A1啟動子螢光素酶報告基因載體為這一研究提供了新的工具。

綜上，我們構建了CYP7A1啟動子螢光素酶報告基因載體，下一步將利用構建的載體研究中藥成分對CYP7A1的調控，以期發現其對內源性膽酸合成代謝的影響。