轉化生長因子β上調肝癌中GP73表達的分子機制

劉寧，孫鶴鳴，趙怡雯，馬雪萍，陳健康，魏從文，鐘輝，楊曉莉

1.武警總醫(yī)院 檢驗科，北京 100039；2.第四軍醫(yī)大學 西京醫(yī)院檢驗科，陜西 西安 710032；3.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 生物工程研究所，北京 100850

轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）是一類結構、功能與生長相關的細胞因子，參與調控多種細胞生物學效應，包括細胞增殖、分化及凋亡。TGF-β有6種亞型，其中TGF-β1亞型的活性最強，發(fā)揮主要的生物學功能[1]。迄今發(fā)現(xiàn)哺乳動物體內至少表達3種TGF-β（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3）的配體，TGF-β1亞型在人體肝臟中的表達最豐富，并且參與調控多種慢性肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展。

肝臟纖維化是各種慢性肝病的病理基礎，而TGF-β1能促進肝星狀細胞（hepatic stellatecells，HSCs）異常活化，使細胞外基質（extracellular ma?trix，ECM）過度沉積，加快成肌纖維細胞的纖維化病變[2-3]。在肝纖維化患者及CCl4誘導的肝纖維化小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)TGF-β1蛋白及mRNA的表達都升高[4]；TGF-β是上皮細胞-間充質轉化（epi?thelial-mesenchymal transition，EMT）的重要調節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)當TGF-β1刺激肝癌細胞時，低表達Smad7或過表達Smad3/4的細胞EMT增強[5]；在肝癌患者中TGF-β通過誘導EMT使癌細胞獲得較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解ECM的能力，促進肝癌的不良預后發(fā)展[6]。

高爾基蛋白73（Golgi protein 73，GP73）是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，由粗面內質網(wǎng)合成，位于高爾基體中。在正常肝臟中GP73少量表達并維持肝臟正常生理功能，而在各種肝臟疾病中表達增高，如病毒性肝炎、肝纖維化、肝癌等[7-8]。研究認為，GP73作為診斷早期肝癌的血清標志物有較高的臨床價值，此外GP73水平還與肝癌組織的分化程度密切相關[9]。Zhang等認為在腫瘤免疫微環(huán)境中γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）能夠誘導GP73表達上調[10]；GP73還能通過調控EGFR/RTK、TGF-β1/Smad2等信號通路促進腫瘤生長、侵襲和轉移[11-12]。然而，腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中GP73表達升高和調控的機制尚不完全清楚。在肝細胞癌中，GP73與TGF-β信號通路均是腫瘤進程中的重要靶分子與信號通路，GP73高表達提示我們考慮是否TGF-β能夠調控GP73的表達。然而，GP73與TGF-β信號通路之間的關系尚未見報道。在本研究中，我們的結果表明TGF-β能激活GP7啟動子，上調GP73 mRNA和蛋白水平。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞HepG2由本實驗室保存；質粒pcDNA3-Flag-GP73為本實驗室構建和保存；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；GP73抗體購自Santa Cruz公司；胎牛血清、α-tubulin抗體購自Sigma公司；兔抗山羊IgG/辣根過氧化物酶、羊抗小鼠IgG/辣根過氧化物酶購自北京中杉金橋公司；質粒轉染試劑jetPRIME購自Polypluse公司；TRIzol-A+總RNA提取試劑、2×TS Reaction mix、gDNA Remover、TransS?cript RT/RI Enzyme mix、Anchored Oligo（dT）18Primer、TransStart Top Green qPCR SuperMix（2×）購自Tiangen公司；hGP73引物（Forward：5′-TGGCCTGC ATCATCGTCTTG-3′；Reverse：5′-CCCTGGAACTCGT TCTTCTCA-3′）由奧科生物技術服務公司合成；Daul-Luciferase Reporter Assay試劑盒購自Pramega公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染

用含10% 胎牛血清、100 mmol/L鏈霉素、100 mmol/L青霉素的DMEM培養(yǎng)基，在含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細胞。以60 mm的培養(yǎng)皿為例，新傳代的HepG2生長到60% ～80% 時給細胞換新鮮的培養(yǎng)基2 mL。

準備2支EP管，各加入200 μL jetPRIME Buffer，分別加入Flag-GP73質粒、Flag-V質粒各2 μg，漩渦振蕩 15 s，再各加入 jetPRIME Reac?tion Reagent 8 μL，渦旋混勻 15 s，靜置 10 min后將配好的轉染工作液加入細胞培養(yǎng)基，4 h后更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基補齊至4 mL，轉染24 h后收取細胞進行下一步操作。

1.3 免疫印跡

根據(jù)收取的細胞數(shù)量加入適量的4×SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清進行SDS-PAGE，根據(jù)蛋白marker的電泳情況判斷目的蛋白的跑膠位置，待目的蛋白分離開后即可轉膜（轉膜條件：18 V，1.5 h）；用含5% 脫脂奶粉的1×TBST室溫搖床孵育1 h封閉PVDF膜，封閉后用1×TBST洗膜3～5 min，重復3次，室溫孵育一抗1 h或4℃孵育過夜，用1×TBST洗膜，重復3次，每次5 min；加入酶標二抗，室溫搖床孵育 1 h，用 1×TBST洗膜 5 min，重復 3次；用Western Lighting Plus ECL試劑顯影。

1.4 細胞總RNA提取，反轉錄PCR，熒光定量PCR

棄去培養(yǎng)基，用1×PBS輕柔洗滌細胞2次，棄去PBS，直接在平皿內加入1 mL TRIzol-A+裂解細胞，用加樣槍吹打幾次并將細胞懸液移至無RNA酶的離心管內，在超凈工作臺內靜置5 min使核酸蛋白復合物完全分離；加200 μL氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min后4℃、12 000 r/min離心10 min，樣品會分成不同顏色的3層，RNA主要存在于無色水相層；將約500 μL水相用加樣槍移至新的無RNA酶離心管中，加入等體積的異丙醇，漩渦振蕩混勻，室溫放置30 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清留取管側和管底的白色膠狀沉淀；用無RNA酶的ddH2O配制的75% 乙醇1 mL洗滌沉淀，輕柔吹打混勻，4℃、5000 r/min離心3 min，棄去上清，室溫放置3 min；根據(jù)管底白色膠狀沉淀的量加入適宜量的DEPC水，反復混勻，充分溶解RNA沉淀；取1 μL用分光光度計測定RNA濃度，記錄并保存?zhèn)溆谩?/p>

以RNA為模板反轉錄合成cDNA，反應體系包括 2 μg 總 RNA、1 μL Anchored Oligo（dT）18Primer、10 μL 2×TS Reaction Mix、1 μL TransS?criptRT/RI Enzyme Mix、1 μL gDNA Remover，用無RNA酶的水補齊反應體系至20 μL，42℃孵育30 min，85℃孵育5 min。

最后進行熒光定量PCR，以2 μL cDNA為模板，加入 10 μL TransStart Top Green qPCR Su?perMix（2×），hGP73的上、下游引物各0.5 μL，用ddH2O補齊反應體系至20 μL。擴增條件：94℃孵育5 s，56℃孵育15 min，72℃ 10 min。

1.5 雙螢光素酶報告實驗

將HepG2細胞傳至12孔培養(yǎng)板中，用TGF-β按實驗條件處理細胞，然后將細胞培養(yǎng)基棄去，用適量的1×PBS輕柔洗滌細胞，避免細胞脫落，盡可能將漂洗培養(yǎng)板的PBS吸出；每孔加入200 μL 1×裂解緩沖液（PLB），于搖床上室溫裂解15 min，得到細胞裂解液，用于檢測螢光素酶；取30 μL細胞裂解液加入EP管中，再加入30 μL螢光素酶檢測試劑（LAR），混勻后用熒光光度計檢測發(fā)光值，然后加入測定作為內參的海腎螢光素酶的30 μL反應終止液，并測得其發(fā)光值，二者的比值為螢光素酶的相對活性（relative luciferase activity，RLA）。

1.6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用Graphpad Prism 5進行數(shù)據(jù)分析，組間數(shù)據(jù)比較采用Dunnettt檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義（*P＜0.05，**P＜0.01）。

2 結果

2.1 TGF-β在蛋白水平影響GP73的表達

用2 ng/mL TGF-β1刺激分別轉染了Flag-V、Flag-GP73質粒的HepG2細胞，在不同時間（0、1、2、4、8 h）點收取細胞并裂解，制樣進行 West?ern印跡，檢測在TGF-β1的刺激下細胞內GP73的表達情況。結果表明，在處理1 h后，不論是否轉染過表達GP73的質粒，GP73蛋白的表達水平都顯著升高，F(xiàn)lag-V對照組4 h達到高峰并持續(xù)到8 h，而過表達GP73組2 h達到峰值，4或8 h后有所下降（圖1A）。下一步又檢測了不同濃度（0、1、2 ng/mL）TGF-β1刺激轉染了Flag-V、Flag-GP73質粒的HepG2細胞，處理時間8 h，Western印跡結果顯示GP73的表達對TGF-β1處理的濃度有劑量依賴性（圖1B）。結果提示，GP73的表達水平受到TGF-β1刺激的影響，表現(xiàn)為時間依賴性和劑量依賴性。

圖1 TGF-β在蛋白質水平影響GP73的表達

2.2 TGF-β在mRNA水平影響GP73的表達

既然TGF-β能影響GP73蛋白的表達，我們猜測TGF-β是否影響GP73 mRNA水平的表達。用2 ng/mL TGF-β1刺激HepG2細胞不同的時間（0、1、2、4、8 h），或用不同濃度（0、1、2 ng/mL）TGF-β1處理HepG2細胞8 h，收取各處理條件的細胞，提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA后進行qPCR，比較不同處理條件的細胞與對照組細胞GP73 mRNA表達水平的變化。結果表明，GP73 mRNA在TGF-β1處理1 h后表達升高，4 h時達峰值，之后開始下降（圖2A）；在0～2 ng/mL TGF-β1濃度范圍內，GP73 mRNA表達水平隨TGF-β1刺激濃度的升高而升高（圖2B）。

圖2 TGF-β在mRNA水平影響GP73的表達

2.3 TGF-β1能直接激活GP73啟動子

TGF-β能在mRNA水平影響GP73的轉錄，那么TGF-β作為轉錄因子是否能與GP73啟動子序列結合，從而影響GP73的轉錄水平？通過分析GP73基因的上游DNA序列，在距離啟動子區(qū)域（轉錄起始位-1005～-998核苷酸處）有一個Smad結合元件（SBE，序列為CAGACA）。分別構建包含GP73啟動子、GP73啟動子突變體序列的螢光素酶報告基因質粒，SEB突變體序列為CACACA（圖3A）。在HepG2細胞內分別轉染這2種質粒，利用雙螢光素酶報告基因方法檢測TGF-β1是否能夠直接激活GP73啟動子。結果表明，TGF-β1刺激能夠激活GP73啟動子轉錄活性增高達6倍多，而當GP73啟動子突變后，轉錄活性并沒有升高（圖3B）。

圖3 TGF-β1能直接激活GP73啟動子

3 討論

在肝癌的發(fā)生發(fā)展中，TGF-β發(fā)揮雙向調控作用。在肝癌早期，TGF-β主要通過Smad信號通路上調細胞增殖周期蛋白依賴性激酶CDKs抑制因子P15、P21的表達，使細胞的生長周期停滯，發(fā)揮抑制癌細胞生長的作用[13]；而在肝癌進展期，TGF-β可以降低IL-2的分泌，抑制抗原呈遞細胞的抗原呈遞作用，繼而免疫T細胞的活化、增殖及B淋巴細胞產(chǎn)生免疫因子受到抑制而不能發(fā)揮正常的免疫殺傷功能，有助于腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸，加快腫瘤進展[14-15]；另一方面，TGF-β能促進腫瘤微環(huán)境中血管內皮生長因子（VEGF），結締組織生長因子（CTGF）的分泌，加快腫瘤血管的生成，誘導成纖維細胞增殖和分泌ECM而加速肝臟細胞的纖維化進程[16]。據(jù)報道，肝癌組織中GP73顯著升高，使細胞黏附分子E-鈣黏蛋白減少，波形蛋白增多，促進腫瘤細胞的侵襲和遷移，與肝癌的不良預后息息相關[17]；肝細胞癌患者血清中TGF-β1的mRNA和蛋白水平均顯著升高，TGF-β 1在肝癌組織中的表達水平、腫瘤大小與有無血管侵襲均有關[18]。而腫瘤組織中GP73蛋白表達升高的分子機制尚不可知，因此，我們推測TGF-β信號通路可能與GP73水平具有密切關系。

本研究中，我們從轉錄水平、翻譯水平探討了TGF-β對GP73表達水平的影響，結果表明TGF-β能與GP73啟動子結合，增強GP73的轉錄水平，進而促進GP73蛋白的表達。因此我們有理由認為，肝癌組織中GP73蛋白的異常表達至少部分受TGF-β的調控，而GP73是否能夠調控TGF-β信號通路有待進一步研究。