重金屬離子對不動桿菌BCL-1降解吡蟲啉的影響

胡桂萍，曹紅妹，石旭平，楊帆，施龍清，杜賢明，王軍文，鄧真華，王禮獻，江新鳳

1.江西省蠶桑茶葉研究所，江西 南昌 330202；2.閩臺作物有害生物生態防控國家重點實驗室，福建農林大學 應用生態研究所，福建 福州 350002；3.江西省蠶桑工程技術研究中心，江西 南昌 330202

［關鍵字］ 不動桿菌；吡蟲啉降解菌；重金屬離子；降解動力學

吡蟲啉是茶葉生產中有效防治茶蚜、假眼小綠葉蟬、茶黃薊馬等害蟲的重要殺蟲劑。噴灑到茶園的吡蟲啉，大約95% 通過蒸騰、揮發、滲透等方式進入茶葉植株和茶園土壤等環境中，有效利用在害蟲上的比例很低。另外茶葉具有自身特殊性，茶葉以采葉為主，單位質量表面積大，噴藥部位是直接采收，且一年多次采摘，加上農藥間隔期短，茶葉上吡蟲啉等農藥殘留量大[1]，同時吡蟲啉在茶葉和茶園土的半衰期分別為5.5[2]和10～150 d[3]，因此，茶葉和茶園土壤吡蟲啉超標問題頻繁出現，也是制約我國茶葉出口的現實問題。

我們通過長期研究發現并優選到多株對吡蟲啉等農藥有強降解作用的微生物，其中不動桿菌（Acinetobacter）BCL-1在實驗室條件下，24 h內對100 mg/g吡蟲啉的降解率可達84%[4]。但是降解菌在室外受多種因子協同作用，不僅包括污染物的濃度，還有多類型污染源疊加阻遏，如重金屬絡合物的生物效應，以及生物因子影響，如環境微生物群落影響等。由于茶樹根系長期富鋁，根系土壤周圍酸化程度高，土壤鹽基離子淋溶活性增強[5]。加之茶園系統中物質與能量循環均受自然與人為活性的雙重影響形成開放系統，系統中銅、鉛、鎘等離子的累積量又高[6]，其中紅壤發育的土壤中銅含量最高[7]，而銅離子為茶園土壤重金屬污染的重要元素[8]。研究表明，土壤中農藥殘留與土壤重金屬污染是協同正相關，而重金屬離子對土壤酶活性和微生物酶活力的作用常常呈現正相關[9-10]。

為了實現吡蟲啉降解菌BCL-1在茶園環境等室外大田的高效利用，需要對其環境因子影響機理進行預判，尤其是對茶園土壤中重金屬離子的影響進行深入探討，為后續降解菌生物反應器的研制提供參考。江西省茶區是重要的紅壤區，土壤酸化嚴重，銅和鎘等重金屬含量超標[11-12]。在此，我們主要探討菌株BCL-1的吡蟲啉降解特性，并重點分析鋁離子和銅離子影響下的降解菌BCL-1的降解動力學和半衰期等參數，為進一步研制適宜江西紅壤茶區茶葉吡蟲啉降污劑提供支撐和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

不動桿菌BCL-1分離自茶葉圍環境，保存于江西省蠶桑茶葉研究所微生物菌種保藏中心。

吡蟲啉標準品（99.8% ）購自國家農藥質檢中心；氯化鈉、硝酸銨、硫酸鎂、KH2PO4、K2HPO4、葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4、酵母提取物、二氯甲烷、鹽酸、甲醇（分析純）、甲醇（色譜純）均為國產試劑。

液相分析儀（安捷倫1260）；其他設備包括高壓鍋、超凈臺、紫外分光光度儀、恒溫振蕩培養箱、pH酸堿計、旋轉蒸發儀、超聲波儀、低溫高速離心機等。

種子培養基：牛肉膏10.0 g，蛋白胨3.0 g，葡萄糖5.0 g，加蒸餾水定容到1 L，pH7.2。

基礎培養基：NaCl 1.0 g，NH4NO31.0 g，K2HPO41.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，pH7.0，以吡蟲啉作為碳源，濃度視需要添加。

1.2 BCL-1降解吡蟲啉動力學研究

將培養好的BCL-1菌懸液，按10% 的比例接種到含100 mg/L吡蟲啉的無機鹽液體培養基中（pH8.0），30℃、150 r/min培養24 h后，對培養液中的吡蟲啉濃度進行0、1、2、3、4、5、6、7 d取樣檢測，檢測菌液的D600nm值及吡蟲啉質量濃度，研究菌株BCL-1在不同吡蟲啉初始濃度下的生長量及降解率，并計算動力學方程和半衰期。試驗設置不接種菌懸液和不含菌體培養基分別作為陽性和陰性對照，每個試驗重復3次。

1.3 重金屬離子對BCL-1降解吡蟲啉的影響

配置濃度為50 mg/kg的銅離子和鋁離子母液，然后按比例添加到100 mg/L無機鹽液體培養基中，分別制備成 10、50、100、200、500 mg/kg銅離子和 10、50、100、500、1000 mg/kg鋁離子濃度的培養基。將新鮮培養的菌體BCL-1細胞按5% 的接種量接種至上述培養基中，25℃、150 r/min搖床培養，24 h后開始取樣，每隔24 h取樣測定培養液中的吡蟲啉濃度，計算降解菌降解率和降解半衰期，所有試驗重復3次，以接種滅活的BCL-1為對照。

1.4 吡蟲啉濃度檢測和分析方法

1.4.1 吡蟲啉的提取 取10 mL培養液于50 mL帶磨口塞的三角瓶中，加入10 mL二氯甲烷和10 mL鹽酸（pH3），蓋上瓶塞，超聲波提取5 min，吸取下層于新的錐形瓶中，上層清液再加入5 mL二氯甲烷超聲波提取2 min，取下層與第一次下層有機相合并，轉入干凈的旋轉蒸發瓶中，調旋轉蒸發儀溫度至40℃，旋轉蒸發干之后，向瓶中加入2 mL色譜級甲醇，旋轉搖蕩使瓶壁上的殘留農藥盡量溶解，過0.45 μm有機濾膜，收集溶液于GC小瓶中，高效液相色譜分析菌株對吡蟲啉的降解率。

1.4.2 吡蟲啉的高效液相色譜檢測 安捷倫1260液相色譜儀，UV檢測器，檢測波長270 nm。色譜柱為 Symmetry C18（0.5 μm×4.5 min×250 mm），流動相為水∶甲醇（20∶80），流速1 mL/min，柱溫保持室溫，運行10 min，吡蟲啉保留時間為3.85 min，進樣量10 μL，采用外標法定量測定。

1.4.3 菌液D600nm值的測定 菌液D600nm值為測定值與空白對照值的差值（以未接種菌液的選擇性培養基D600nm值作為空白對照值）。

1.5 動力學方程

BCL-1降解吡蟲啉的過程用一級反應動力學方程描述，半衰期計算公式如下：

對式兩邊同時取自然對數：

式中，Ct為t時刻培養基中農藥的殘留濃度（mg/L）；Co為吡蟲啉的初始濃度（mg/L）；k為降解速率常數（d-1）；t為降解時間（d）。

半衰期（t1/2）為農藥降解50% 所需時間（d）：

2 結果

2.1 不動桿菌BCL-1的生長特性及其對吡蟲啉的降解特性

不動桿菌BCL-1在吡蟲啉基礎培養基中的生長曲線見圖1，符合一元二次回歸方程。接種后第4 d菌株生長量達到最高，第5 d后迅速下降。但BCL-1對吡蟲啉降解菌的降解率（圖2）呈線性上升趨勢，第5 d的降解率僅為57.5% ，而第6 d和第7 d更高，分別達到65.7% 和87.9% 。這主要與菌株代謝物生產量和代謝物中的水解酶、氧化還原酶的生成有關，菌株在第5 d雖然生物量最高，但代謝物累積量未達到最高，因此，第6 d和第7 d的吡蟲啉降解率更高。

圖1 吡蟲啉降解菌BCL-1的生長曲線

2.2 不動桿菌BCL-1降解吡蟲啉的一級反應動力學和半衰期

通過對不動桿菌BCL-1降解動態進行動力學分析并計算半衰期得到（圖3），BCL-1降解吡蟲啉的一級反應動力學公式為y=55.175e-0.271x，半衰期為2.56 d，顯著低于已報道的茶葉和茶園土中吡蟲啉的半衰期，郭冬梅報道的吡蟲啉在江西紅壤中的半衰期是12.9 d[2]，這為BCL-1在茶產業吡蟲啉降污中的開發應用奠定了前景。

2.3 重金屬離子對BCL-1降解吡蟲啉的影響

菌株BCL-1在添加不同濃度Cu2+的吡蟲啉基礎培養液中的降解特性見圖4。各濃度Cu2+處理下BCL-1對吡蟲啉的降解率均與空白對照的變化趨勢一致，無差異，均呈現前5 d快速上升達到最高和第6 d緩慢降低的趨勢。第5 d，10、50、100、200、500 mg/kg Cu2+作用下的降解率分別為59.84% 、62.49% 、62.96% 、66.26% 、64.84% ，空白對照的降解率為57.52% 。

圖2 菌株BCL-1的吡蟲啉降解特性

圖3 菌株BCL-1降解吡蟲啉的動力學模型

往100 mg/L的吡蟲啉基礎培養液中分別添加10、50、100、500、1000 mg/kg的 Al3+后，動態測定菌株BCL-1對吡蟲啉的降解率，結果見圖5。與對照相比，添加10、50、100 mg/kg的Al3+后，吡蟲啉降解菌同期均比對照高，且與Al3+濃度呈負相關。添加10 mg/kg Al3+的降解率同期最高，第5 d達最高為79.51% ，而對照第5 d也達最高，但降解率僅為57.19% ；次之為50 mg/kg Al3+,降解率第5 d為75.56% ，其次為100 mg/kg Al3+，第5 d的降解率為73.97% 。但500和1000 mg/kg Al3+處理后吡蟲啉降解率同期均低于對照，5 d后的降解率分別為34.14% 和36.18% 。可以看出，不同濃度Al3+對吡蟲啉降解率有影響，低于100 mg/kg的Al3+可以提高BCL-1對吡蟲啉的降解能力，而在高于500 mg/kg Al3+的環境中，BCL-1對吡蟲啉的降解能力受到抑制。

2.4 不同重金屬離子對菌株BCL-1降解吡蟲啉的動力學和半衰期的影響

分析不同濃度Cu2+和Al3+對菌株BCL-1降解吡蟲啉的動力學和半衰期的影響，結果見表1。5種濃度 Cu2+（10、50、100、200、500 mg/kg）處理下的半衰期分別為2.16、2.06、2.14、2.08、2.12 d，與空白對照的半衰期2.26 d相比無差異，表明Cu2+對BCL-1的降解作用無影響。而不同濃度Al3+作用下BCL-1的降解動力學和半衰期差異很大，其中10、50、100 mg/kg Al3+處理下的半衰期分別為1.52、1.56、1.75 d，明顯低于空白對照的 2.26 d，而500和1000 mg/kg Al3+處理下的半衰期分別為3.67和3.52 d。從半衰期可以看出，Cu2+不影響菌株BCL-1降解吡蟲啉的特性，而低濃度的Al3+對BCL-1降解吡蟲啉有促進作用，高濃度的Al3+會抑制BCL-1降解吡蟲啉的能力。

圖4 不同濃度Cu2+對菌株BCL-1降解吡蟲啉的影響

圖5 不同濃度Al3+對菌株BCL-1降解吡蟲啉的影響

表1 不同濃度Cu2+和Al3+作用下BCL-1降解吡蟲啉的動力學方程和半衰期

3 討論

一般而言，強降解效能的菌株具有農藥強耐受性和高適應性特性，能以農藥作為重要營養源。本研究中的吡蟲啉降解菌BCL-1在100 mg/L吡蟲啉無機鹽中生長旺盛，在第5 d可以達到生長高峰，而降解能力一直持續上升直到第7 d，這與BCL-1在生長過程中產生的分泌物中含有大量降解酶有關。不同的金屬離子對不同菌株降解農藥的作用方式不同，即使是同一種金屬離子，對同一菌株降解不同農藥作用的影響也是有差異的[13-14]。金屬離子對菌株降解甲胺磷農藥有不同程度的促進或抑制作用，Cu2+可以促進菌株HK1降解甲胺磷[15]。同一金屬離子對不同菌株降解甲胺磷產生不同的促進或抑制作用，說明不同菌株產生的降解酶系不同。Cu2+抑制嗜麥芽寡養單胞菌1對阿特拉津的降解[16]。但本研究中我們發現，不同濃度的Cu2+對菌株BCL-1降解吡蟲啉無影響，半衰期與對照相比也無明顯差異，而低于100 mg/L的Al3+可以促進吡蟲啉的降解，高于200 mg/kg的Al3+會強烈抑制吡蟲啉的降解，說明BCL-1菌株及其酶系作用不受Cu2+的影響，但是與環境的酸堿度影響。茶園根系呼吸作用會分泌大量蘋果酸、檸檬酸、草酸等有機酸和多酚類物質，對鋁具有很強的絡合能力，促進了固定態鋁的活化，活化的鋁可以吸附羥基或與氫離子交換，高濃度Al3+增進土壤酸化[5]。從這點可以看出，BCL-1及其吡蟲啉降解酶系不耐強酸，但不受Cu2+的影響。

茶園土壤是一個多體系復合體，還有大量其他金屬離子，如鎘離子、汞離子等也是茶園重金屬污染的重要元素，這些重金屬離子的絡合作用對于降解菌有一定的影響[17]，對降解酶有影響[18]，進而影響降解菌的室外投放效能。本研究探討了Al3+和Cu2+對BCL-1降解吡蟲啉的影響，還需對其他影響因素及機制進行多維度分析，才能全面客觀地明晰BCL-1降解環境毒物的機制，為BCL-1降污劑產業化提供依據。